A szem válasza intrakamerás injekcióra
Az ACAID indukciójában központi szerepet játszó F4/80+ monocita sejtek feltételezhetően rezidens írisz és ciliáris test sejtek, amelyek az íriszből a Schlemm-csatornán keresztül1,6,10 a keringésbe emigráltak. Mivel az antigén legalább 24 órán keresztül jelen van a szemben, az antigénnek “depóhatása” lehet, bár az antigén intrakamerális beadása után az antigén egy része gyorsan bekerül a keringésbe8. Mivel az antigén intrakamerális injekciója ACAID-indukáló PBMC-k megjelenését idézi elő, valószínű, hogy ezek a monocita sejtek, nem pedig a keringő antigén önmagában idézi elő az ACAID-ot.
Az antigén intravitreális injekciója monocita sejtek beszivárgását idézi elő a retinába az uveitis korai szakaszaként.11,12. Ezenkívül a szemészeti fertőzés erős gyulladásos infiltrátumot indukál a hátsó vagy elülső kamrában.12-14 Az ilyen gyulladással összhangban a gyulladásos citokinek emelkedése tapasztalható a szemészeti folyadékokban, például a vizes nedvben. Ennek megfelelően a szemcsés antigén intrakamerás injekciója a TNF-α mRNS-ének emelkedését idézi elő, ami korai gyulladásos válaszreakcióra utal az elülső kamrában.14,15 Emellett a késleltetett típusú túlérzékenység szisztémás szuppressziója nem indukálódik olyan egerekben, amelyek az antigénnel együtt TNF-α ellenes antitestek intrakamerás injekcióját kapták, ami arra utal, hogy a TNF-α szükséges az ACAID indukciója során. Ráadásul az ACAID indukciója ezekben a vizsgálatokban az oldható fehérjék intrakamerális injekciójához használt tű méretétől függött, valamint attól, hogy az antigén részecske vagy oldható formában volt-e.15 Ezek a szerzők azt sugallták, hogy a részecske antigének intrakamerális injekciója és/vagy az intrakamerális injekcióhoz használt tű mérete az ACAID kiváltásához szükséges traumát idézi elő. A CD11c dendritikus sejtmarkert expresszáló makrofágok és dendriform sejtek az elülső szegmentumban az íriszben, a ciliáris testben és a chorioideában rezidensek.8,10,16,17 Az elülső kamrába injektált antigént ezek a sejtek gyorsan felveszik. Emellett makrofágok és dendriform sejtek találhatók a Schlemm-csatorna közelében17,18 , amelyről úgy vélik, hogy az F4/80+ sejtek elülső kamrából a keringésbe való kilépésének helye.1 Az antigént elnyelő rezidens íriszsejtek keringésbe való kilépését azonban megkérdőjelezték.16 Az oldható antigén gyorsan elhagyja az elülső kamrát a keringésen keresztül, és az intravénás antigénhez hasonlóan oszlik el.8 A szemből kilépő antigén egy része tolerogén formában is lehet.19 Valószínű azonban, hogy az intrakamerális antigént a timuszban és a lépben az antigénnel együtt a szemből kilépő, úgynevezett “tolerogén antigénprezentáló sejtek” mutatják be. Ezenkívül a vizes nedvben lévő vagy az írisz F4/80+ sejtjei által termelt TGF-β szuppresszív fenotípust indukál a perifériás F4/80+ sejtekben10,20,21 , ami arra utal, hogy az F4/80+ sejtek szuppresszív fenotípusának indukciója az elülső kamrában történik.
A perifériás F4/80+ sejtek vizes nedvvel és antigénnel történő kezeléséhez hasonlóan az F4/80+ peritoneális exsudátum sejtek antigénnel és TGF-β-vel történő in vitro inkubálása szuppresszív fenotípust kényszerít a sejtekre. Amikor ezeket a sejteket iv. injekcióval naiv egerekbe juttatjuk, az antigén intrakamerális injekciójával kapott antigénhez hasonló antigén-specifikus szabályozó T-sejteket indukálnak.21 Az ACAID-ot nagyon kevés, ilyen módon kezelt F4/80+ sejt indukálja1 , ami arra utal, hogy az íriszből és a csillótestből kivándorló (nem kimutatható) sejtek ACAID-ot indukálhatnak. Ezenkívül az antigén intrakamerális injekciójában részesült egerekből kinyert F4/80+ íriszsejtek ACAID indukcióját idézik elő, vagy az F4/80+ PBMC-nek az antigén intrakamerális injekciójában részesült egerekből kinyert keringő sejtekhez hasonló szuppresszív fenotípust kölcsönöznek.9,21 Valószínű, hogy az írisz antigénprezentáló sejtjei által felvett és feldolgozott antigén ugyanúgy átkerülhet az elülső kamrát infiltráló PBMC-kbe, mint ahogyan a TGF-β-val kezelt, antigént hordozó peritoneális exsudátum sejtek által a lépben lévő ACAID-indukáló B-sejtekre is átkerül az antigén.22 Ezek a megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy az elülső kamrában zajló események szuppresszív fenotípust indukálhatnak az elülső kamrába beszivárgó nem rezidens gyulladásos sejteken.
A fenti megfontolások alapján megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy az antigén intrakamerás injekciója a keringő PBMC beáramlását indukálja az elülső kamrába az injekció traumája miatt. Ezek az infiltrált sejtek ki lennének téve a vizes nedvben lévő immunszuppresszív TGF-β-nek és a rezidens írisz/ciliumtest dendriform sejteknek, amelyek bemutathatják az injektált antigént az infiltrált PBMC-nek. Ezzel a hipotézissel összhangban az injekció által okozott sérülés miatt az elülső kamrába toborzott sejtek ezután recirkulálnak és hazatérnek a thymusba és a lépbe, ahol szabályozó T-sejteket indukálnak.
Az ovalbumin (OVA) intrakamerás injekcióját követő 3 órán belül szintén a TNF-α emelkedését találtuk a vizes nedvben, ahogy azt Ferguson és munkatársai leírták.15 Emellett az intrakamerális injekciót követően hat órával az MCP-1 kemokin emelkedését figyeltük meg a vizes nedvben (1. ábra). A PBS injekció nélküli tűszúrás a TNF-α megjelenését idézte elő a vizes nedvben, és a PBS injekció csak a TNF-α mennyiségét növelte ötször nagyobb mértékben, mint a tűszúrással kapott érték. A TNF-α a vizenyőben gyorsan csökken, és 12 órával az ovalbumin (OVA) intrakamerális injekciója után már nem mutatható ki (az adatok nem láthatóak). Az MCP-1 hosszabb ideig megmarad a vizes nedvben. A TNF-α-val ellentétben azonban az MCP-1 csúcsszintje 12 órán belül eléri a víztartalmú folyadékban, és 16 órával az OVA intrakamerális injekciója után is megmarad (az adatok nem láthatóak). A TNF-α és az MCP-1 szintjének emelkedése a víztartalmú folyadékban az antigén intrakamerás injekcióját követően gyulladásos válasz beindulására utal az elülső kamrában. Ráadásul a TNF-α nem emelkedik a vizes nedvben, és az ACAID sem indukálódik, ha az intrakamerás injekcióhoz használt tű túl kicsi és/vagy az antigén nem gyulladásos.15
Az antigén intrakamerás injekciója megemeli a TNF-a és az MCP-1 szintjét a vizes nedvben. Három-6 órával azután, hogy 6-8 hetes naiv nőstény BALB/c egerek iv. 5 × 106 – 1 × 107 CFSE-jelölt PBMC-t kaptak, az egereket ketamin/xilazin7 ip injekcióval altatták, és PBS, PBS + 50 μg OVA intrakamerális injekciót vagy csak tűszúrást kaptak 24 g-os tűvel. Hat órával azután, hogy a naiv egerek intrakamerás injekciót kaptak, az eutanáziával elaltatott egerekből vizes nedvet nyertünk, és 10 μl-t ELISA-próbával TNF-α-ra és MCP-1-re vizsgáltunk. Az adatok a 2-3 kísérletben 4-6 ismétlés/csoport 4-6 pg átlagát +/- S.E.M. jelentik.
Az antigén intrakamerális injekcióját követően gyulladásos sejtek egyidejű beáramlása következik-e be az elülső kamrába, a CFSE fluoreszcens festékkel jelölt PBMC-vel iv. injektált egerek szintén intrakamerális injekciót kaptak. Ezzel a módszerrel a CFSE-vel jelölt és nem jelölt (gazdaszervezet) F4/80+ monocita sejtek jelentős beáramlását figyeltük meg, amelyek a CCR2 és CCR5 kemokin receptorokat expresszálják, amint azt az egerek íriszéből 24 órával azután, hogy az egerek intrakamerális antigéninjekciót kaptak, e sejtek visszaszerzése mutatta. Azokban a kontrollokban, amelyek iv CFSE-jelölt PBMC-t kaptak, de nem kaptak intrakamerás antigéninjekciót, nem volt növekedés ezekben a sejtekben.23 Körülbelül 48 órával az antigén intrakamerás injekcióját követően az írisznél a beszivárgott sejtek száma csökken, a tímuszban és a lépben pedig nő (2. ábra). A keringő monocita sejteknek ez a növekedése az írisznél valószínűleg a keringő monocitáknak az intrakamerális injekció +/- a PBS és/vagy az antigén/PBS irritáló hatására bekövetkező traumára adott válaszként történő infiltrációjának köszönhető, mivel az egerek intrakamerális antigén beadásakor az infiltrált monocita sejtek száma nőtt: a CFSE-jelölt PBMC-k infiltrációja, amelyet csak az injekció indukált, <PBS injekció < TNP-BSA/PBS injekció < volt. Az antigén intrakamerális injekcióját követően az íriszbe toborzott monocita sejtek mind a CCR2-t, mind a CCR5-öt expresszálják.23 A sejtek íriszbe történő vándorlása a CCR2 expresszióját igényli, de a CCR5-ét nem, mivel a CCR2 -/- PBMC nem telepszik az íriszbe, de a CCR5 -/- PBMC az íriszbe telepszik az antigén intrakamerális injekcióját követően. Továbbá, az OVA intrakamerás injekciója CCR2 -/- egerekbe nem indukál keringő monocita sejteket, amelyek a késleltetett típusú túlérzékenység (DTH) szuppresszióját adják át az OVA-ra, amikor iv. injekciót adnak vad típusú recipienseknek.23
A PBMC migrációja intrakamerás injekció után. Altatott7 BALB/c egerek trinitrofenilált szarvasmarha-albumin intrakamerális injekcióját kapták hat órával azután, hogy az egerek iv. 5 × 106 -1 × 107 CFSE-jelölt PBMC-t kaptak. Huszonnégy órával az intrakamerális injekció beadása után az egereket CO2-inhalációval elaltattuk, majd eltávolítottuk az íriszeket, a lépet és a tímuszmirigyet, összevontuk őket, és egyedi sejtszuszpenziókat készítettünk. A sejteket ezután fikocianin-anti-F4/80-zal jelöltük és áramlási citometriával elemeztük. A CFSE,F480+ sejtek százalékos növekedését a következőképpen számoltuk ki: