Szerkezeti implikációk
A cisztein tartalmú mutáns fehérje (K41C) brom-etilaminnal történő módosításának eredménye egy olyan enzim, amely meglehetősen közel áll a vad típusú RNáz A-hoz. Mégis, a K41S-etilaminocisztein RNáz A katalízis kcat/Km értéke csak 8%-a a vad típusú enzimének. A két fehérje közötti különbség a tioétercsoport és a metiléncsoport közötti különbségben rejlik. Bár a C-S-C kötések szögei általában hegyesebbek, mint a C-CH2-C kötésekéi, ezt a különbséget ellensúlyozza a C-S kötések nagyobb hossza.3g,14 A molekuláris modellezés azt mutatja, hogy az S-etilaminocisztein és a lizin primer amincsoportjai 0,1 Å-n belül egymásra helyezhetők. Az S-etilaminocisztein és a lizin közötti jelentősebb különbség az, hogy viszonylag jobban preferálják a gauche, mint az anti torziós szögeket.15 A CC-CC kötések anti-konformációja a modellvegyületekben körülbelül 0,8 kcal/mollal előnyösebb.16 Valóban, az átlagos K41 torziós szög (175 ± 3)° az RNáz A és a ciklikus 2′,3′-uridin-vanadát (U>v), egy feltételezett átmeneti állapotú analóg komplexben (2. ábra). A CC-CC kötésekkel ellentétben a CS-CC kötések gauche-konformációja 0,05-0,20 kcal/mollal kedvezőbb.17 A molekuláris modellezés azt mutatja, hogy a 41. pozícióban lévő S-etilaminocisztein maradék CS-CC kötése a natív fehérje szerkezetének megzavarása nélkül lehet gauche-konformációban. Így a 41-es pozícióban lévő tioéter oldalláncok valószínűleg kevésbé merevek és megnyúltak, mint az alkil oldalláncok. Ezért feltételezzük, hogy az S-etilaminocisztein enzim által végzett katalízis nem olyan hatékony, mint a vad típusú RNáz A által végzett, mivel a tioéternek az all anti-konformációban való rögzítése entrópikus költséggel jár.”
Az RNáz A aktív helyének szerkezete uridin-2′,3′-ciklikus vanadáthoz kötve. A szerkezetet 2,0 Å-ra finomítottuk a pH 5,3-on növesztett kristályokból gyűjtött röntgen- és neutron diffrakciós adatokból. A 120-as fenilalanin oldallánc és az uracil bázis nem látható.
A katalitikus hatékonyság a 41-es maradék oldalláncának hosszától függ. Azok az RNáz A változatok, amelyek a lizinnél hosszabb oldallánc végén egy aminocsoportot mutatnak be, aktívabb katalizátorok, mint a nem módosított K41C RNáz A. Így a további hossz tolerálható az aktív centrumban. Még mindig aktívabbak azok az enzimek, amelyekben a 41-es pozícióban lévő aminocsoportot 4 atom választja el a főlánctól, mint azok, amelyekben 5 atom választja el. Ez az eredmény a további konformációs entrópiából vagy a hosszabb oldalláncok kedvezőtlen torziós szögeiből adódhat.
Nincs jelentős előnye annak, ha a 41-es maradék egy második hidrogénkötést is tud adni. A guanidino- és acetamidino-csoportok képesek egyszerre több foszforilcsoport oxigénjével is kölcsönhatásba lépni. Például a guanidinocsoportot a HIV-1 Tat fehérje18 és a mesterséges receptorok foszforilcsoportok megkötésére használják.19 Továbbá a Staphylococcus nukleázban és a T1 családba tartozó ribonukleázokban egy arginin tűnik a K41 szerepét betöltő RNáz A-ban.20 A K41-et egy arginin-maradékkal és egy S-acetamidino-maradékkal helyettesítettük, amely az arginin rövid analógja. A ΔΔG‡ értékei ezekre az enzimekre kisebbek, mint az analóg enzimeké, amelyeknek csak egy primer aminocsoport van a 41-es pozíció oldalláncában. Úgy tűnik tehát, hogy egy hidrogénkötés elegendő a hatékony katalízishez. Ez az eredmény összhangban van az RNáz A és az U>v kristályos komplexével (2. ábra). Az U>v vanadilcsoportja megközelítőleg trigonális bipiramis, két nem áthidaló egyenlítői oxigénnel, O1V és O3V. Az O1V oxigén hidrogénkötést fogad el a 11-es glutamin oldalláncától, míg az O3V hidrogénkötést fogad el a 120-as fenilalanin főláncától. Csak az O1V van abban a helyzetben, hogy hidrogénkötést fogadjon el a K41-től.
Mechanikai implikációk. A K41-nek leggyakrabban tulajdonított katalitikus szerep az, hogy stabilizálja a nem áthidaló foszforil-oxigéneken az RNS hasítása során felhalmozódott felesleges negatív töltést (2. ábra). A töltés felhalmozódása egy pentakoordinált átmeneti állapotban (vagy foszforán intermedierben) történhet, amikor a 2′ hidroxilcsoport megtámadja a foszfort, az 5′ nukleozid kiszorítása felé vezető úton. Feltételezték, hogy ez a stabilizáció Coulombos kölcsönhatások révén történik.12c,21 Nemrégiben azonban azt is javasolták, hogy a stabilizáció egy rövid, erős hidrogénkötés révén történik, amely magában foglalja egy proton részleges átadását a K41-ről.22
A lizinmaradék kiemelkedő jellemzői a pozitív töltés és a hidrogénkötések adományozására való képessége. Az 5 félszintetikus enzim közül háromnak, valamint a K41R-nek közösek ezek a tulajdonságai. Nem egyszerű dolog különbséget tenni a kizárólag Coulomb-erőkön alapuló kölcsönhatás és a két töltött faj közötti hidrogénkötéseken alapuló kölcsönhatás között. Az alábbiakban a legegyszerűbb magyarázat következik, amely összhangban van az 1. táblázatban szereplő adatokkal.
A hidrogénkötések és a Coulomb-erők közötti különbségtétel sehol sem nyilvánul meg jobban, mint az S-etil-trimetil-aminocisztein enzim, amely rendelkezik egy terminális pozitív töltéssel, de nem képes hidrogénkötést adni, és az S-acetamidocisztein enzim összehasonlításánál, amely rendelkezik egy amid N-H-val a potenciális hidrogénkötés adományozásához, de nincs pozitív töltése. Az S-etil-trimetil-aminocisztein enzim alacsony katalitikus aktivitása erősen ellene szól a Coulomb-erők hatékonyságának az átmeneti állapot stabilizálásában. Ha minden más tényező egyenlő, a töltés-töltés kölcsönhatás energiája csak a távolság inverzével csökken. Az oldallánc pozitív töltése és a foszforil-oxigének közötti megnövekedett távolságot az S-etilaminocisztein enzimhez képest a metilcsoportok kényszerítik ki. Mégis, ez a távolság valószínűleg nem elég nagy ahhoz, hogy a megfigyelt >103-szoros kcat/Km csökkenést okozza, különösen mivel a három metilcsoport könnyen elhelyezhető a foszforil-oxigének közelében (2. ábra).
A hidrogénkötés erőssége várhatóan fordítottan korrelál a leadott proton pKa-jával, mivel a hidrogénkötés bizonyos mértékű protonátadással jár.23 Amint az 1. táblázatban látható, a pKa növekedése valóban megfelel a ΔΔG‡ csökkenésének a hasonló hosszúságú oldalláncokkal rendelkező félszintetikus enzimek esetében. Azoknak a félszintetikus enzimeknek az esetében, amelyekben az oldalláncok hossza a lizinhez hasonló, a korreláció azonban nem lineáris. Ez a linearitás hiánya abból adódhat, hogy az egyes oldalláncok pKa értéke a natív fehérjében lévő sajátos környezetüktől függ. Valóban, a Lys41 pKa értékét 9,0-nak,24 és nem 10,6-nak határozták meg, ahogyan az 1. táblázatban a butilammóniumion esetében szerepel. A különböző oldalláncok különböző mértékben lehetnek érintettek. A nemlinearitás másik, talán jelentősebb forrása az, hogy a töltött fajok hajlamosak erősebb hidrogénkötésekben részt venni, mint a töltés nélküliek. Ezt a jelenséget fehérjék25 és kis molekulák, köztük aminok esetében is megfigyelték.26 Az izoszterikus, de formális töltésükben eltérő oldalláncú félszintetikus enzimek összehasonlításával fel kell tárni minden ilyen tendenciát. Például az S-acetamidinocisztein és az S-acetamidocisztein enzimekben a 41-es pozícióban lévő oldalláncok azonosak, kivéve a terminális szénhez kapcsolódó két heteroatom egyikét. Mégis, e két izológ oldalláncnak az átmeneti állapothoz való kötődési képessége közötti különbség nagyobb, mint ami pusztán a savasságuk alapján várható. Itt a töltött acetamidin által leadott hidrogénkötés 4 kcal/mollal erősebb, mint a töltés nélküli amid által leadott hidrogénkötés. Ez az érték összhangban van a fehérje-ligandum kölcsönhatásokban a töltött és nem töltött hidrogénkötések relatív erősségére vonatkozó más adatokkal.21 Végül, figyelemre méltó, hogy bár az S-acetamid oldalláncnak nincs formális töltése és viszonylag magas a pKa értéke, mégis hozzájárul (bár szerény mértékben) a katalízishez. Ez az eredmény további bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a 41-es maradék által adományozott hidrogénkötés fontos szerepet játszik a katalízisben.