Cell survival after irradiation
Investigation of radiation-induced cell growth and death, amelyet a proliferációs képesség teljes elvesztéséhez vagy a proliferációs képesség felerősödéséhez szükséges időtartamként határoznak meg, az egyik leggyakrabban és legmegbízhatóbban alkalmazott módszer a sugárzás sejtekre gyakorolt hatásának tanulmányozására. A besugárzási kísérleteknél laboratóriumunk igazolta, hogy a 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium-bromid (MTT) mérési eredmények arányosak az in vitro sejtek számával, legalábbis az exponenciális növekedés fázisában (az adatok nem láthatóak). A 12C6+ ionok nagy energiájú besugárzása általában a sejtek túlnyomó többségének elhalását eredményezi. A besugárzást követő késleltetési fázisban bekövetkező sejthalál aránya és a megduplázódási idő változása mérhető a besugárzást követő különböző időpontokban végzett vizsgálatokkal. Mivel a mi vizsgálatunk nem csak a túlélés egypontos meghatározása volt, a növekedési teljesítményre vonatkozó információkat is könnyen meg lehetett szerezni. A túlélési görbét a túlélési hányad természetes logaritmikus skálán rajzoltuk fel a különböző fizikai paraméterek függvényében.
C. tyrobutyricum 25755 sejteket 20 órával a beültetés után besugároztuk. A legalacsonyabb metabolikus aktivitású és leglassabban szaporodó törzseket vagy a szaporodásukat abbahagyó sejteket mosással és tripszinizálással zártuk ki a vizsgálatból, amikor a besugárzás után a beültetést elvégeztük. Az (1) egyenlet alapján kapott túlélési hányadot összehasonlítottuk egy reprezentatív kísérleti adatsorral. Az 1. ábra a C. tyrobutyricum ATCC 25755 különböző törzseinek 12C6+-ion besugárzást követő túlélési görbéinek összehasonlítását mutatja különböző sugárenergiák mellett. Az MTT-vizsgálat eredményeit a besugárzási dózis (10-50 Gy) függvényében ábrázoltuk 68 AMeV energián és 106-108 ion – impulzus-1 szinten, amelyek az 1A. ábrán e0 → e-4,5, az 1B. ábrán e0 → e-5,8 és az 1C. ábrán e0 → 0 voltak. Az 1D-F ábrák a sejtek túlélési adatait mutatják az MTT-teszt eredményeiből a besugárzási dózis (10-50 Gy) függvényében 114 AMeV energián és 106-108 ion – impulzus-1 szinten, amelyek e0 → 0. Általában megfelelő egyezést kaptunk a számítások és a kísérleti adatok között. A 68 AMeV-en kezelt törzsek esetében az egyenlet alábecsülte a dózis hatékonyságát, míg a nagy energiával (114 AMeV) besugárzott sejtek esetében az eredmény túlbecsült volt. A maximális eltérés, amelyet a számított és a mért dózisok arányából vezettek le egy adott hatásszintre, 15% volt. A törzsek túlélési hányada erősen függött a 12C6+-ionnyaláb sajátos fizikai jellemzőitől, amelyet a vizsgált részecskék energiája, dózisa és ionok – impulzus-1 szintjei határoztak meg (1. ábra). A túlélési hányad nyilvánvalóan csökkent a szénionok energiájának növekedésével. A várakozásoknak megfelelően a vizsgálatok túlélési logaritmusa ugyanazokat a jellemzőket mutatta: a túlélés függött a 12C6+-ion besugárzás energiájától, ion-impulzus-1 értékétől és dózisától. Egy-egy fizikai paraméter növelése a túlélési arány csökkenéséhez vezetett. Nagyon korlátozott túlélést (e-3,5 → e-6,5) kaptunk, amikor a 12C6+-iont 114 AMeV energiával, 20-40 Gy dózissal és 106-108 ion-impulzus-1-gyel sugároztuk be.
A 12C6+-ion besugárzás hatása a Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 túlélésére. A sejteket 20 órával a beültetés után besugárzottuk, és a túlélés mértékét MTT-teszttel határoztuk meg. A túlélési adatokat a besugárzási szintek függvényében ábrázoltuk. (A-C) A 12C6+-ionokat 68 AMeV-ig gyorsítottuk, és ionjaik/impulzus 106 és 108 között voltak, 10 és 50 Gy közötti dózisteljesítmény mellett. (D-F) A 12C6+-ionokat 114 AMeV-ig gyorsítottuk, és ionjaik/impulzusuk 106 és 108 között változott, 10 és 50 Gy közötti dózisteljesítmény mellett. Az alacsony metabolikus aktivitású és lassú proliferációjú sejteket vagy a szaporodásukat abbahagyó sejteket mosással és tripszinizálással zártuk ki a vizsgálatból, amikor a besugárzás után végeztük a lemezképzést.
Sok sejttípusra jellemző a 12-24 óránként történő rendszeres sejtosztódás. Az exponenciális növekedés ereje miatt egyetlen sejt körülbelül 9-12 normál osztódási ciklus, azaz néhány nap alatt több ezer leánysejtet képes létrehozni. A besugárzás után a túlélők ezután néhány mutánsból állhatnak össze. A C. tyrobutyricum ATCC 25755 túlélők egy nagyon kis százaléka mutathat jobb képességet a butirát termelésére.
A vajsav hatása a sejtnövekedésre besugárzást követően
A C. tyrobutyricum ATCC 25755 szén- és energiaforrásként glükózt vagy xilózt használ. A monoszacharidot egy foszfoenolpiruvát-függő foszfotranszferáz felvételi rendszeren keresztül szállítja a sejtbe. Ezt követően a glükóz vagy xilóz glikolízis útján metabolizálódik, ami a pH 7 és pH 5,5 közötti tartományban jelentéktelen pH-függést mutat. A fermentációk azonban leálltak, amikor a sejtek már nem fogyasztottak glükózt vagy xilózt a butirát által okozott gátlás miatt. A besugárzásnak a sejtnövekedési profilokra gyakorolt specifikus hatásának további vizsgálatához (a sejtszuszpenzió 600 nm-en mért optikai sűrűségének (OD) mérése alapján) egyedi szakaszos tenyésztéseket végeztünk kémiailag meghatározott P2-közegben (szérumos üvegekben), amely 42 g-L-1 glükózt tartalmazott, és 3,6, 7,2 és 10,8 g-L-1 vajsavval egészült ki. A C. tyrobutyricum ATCC 25755 kultúra pH-ja (2A ábra, kontroll) 4,8 körüli értékre csökkent (ΔpH 1,4, a pH 6,2-ről), szemben azzal, amikor 3,6 g-L-1 vajsavval egészítettük ki (2A1 ábra), 7 g-L-1 vajsavval (2A1 ábra).2 g-L-1 vajsavval (2A2. ábra) és 10,8 g-L-1 vajsavval (2A3. ábra), a megfelelő pH-értékek körülbelül 6,0 (ΔpH 0,5 a 6,5-től kezdve), 6,1 (ΔpH 0,3 a 6,4-től kezdve) és 5,9 (ΔpH 0,5 a 6,4-től kezdve) voltak. Amikor azonban a kultúrát 68 AMeV-vel 40 Gy dózisban besugároztuk (2D ábra, kontroll), a pH 4,8 körüli értékre csökkent (ΔpH 1,7 6,5-től kezdődően), míg 40 Gy dózis mellett (3,6 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2D1 ábra), 40 Gy dózis mellett (kiegészítve 7.2 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2D2. ábra) és 40 Gy dózisnál (10,8 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2D3. ábra) a pH-értékek körülbelül 4,6 (ΔpH 1,6 6 6,2-től kezdve), 4,8 (ΔpH 1,4 6,2-től kezdve) és 5,9 (ΔpH 0,3 6,2-től kezdve) voltak. Amikor a tenyészetet 114 AMeV és 40 Gy dózis mellett besugároztuk (2G ábra, kontroll), a pH 5,7 körüli értékre csökkent (ΔpH 0,6 6 6,3-tól kezdődően), míg 40 Gy dózis mellett (3,6 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2G1. ábra), 40 Gy dózis mellett (7.2 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2G2. ábra) és 40 Gy dózisnál (10,8 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2G3. ábra) a pH-értékek körülbelül 5,7 (ΔpH 0,6 6-tól 6,3-ig), 5,4 (ΔpH 0,9-től 6,3-ig) és 5,6 (ΔpH 0,7-től 6,3-ig) voltak. Amikor a kultúrát 68 AMeV-en és 20 Gy dózisban (7,2 g-L-1 vajsavval kiegészítve) besugároztuk (2B2. ábra), a pH 4,4 körüli értékre csökkent (ΔpH 0,9 6,3-tól kezdődően), míg 30 Gy dózisban (7.2 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2C2. ábra) és 40 Gy dózisnál (7,2 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2D2. ábra) a pH-értékek körülbelül 4,6 (ΔpH 1,7 a 6,3-tól kezdve), illetve 4,8 (ΔpH 1,5 a 6,3-tól kezdve) voltak. Amikor a tenyészetet 114 AMeV és 40 Gy dózissal (10,8 g-L-1 vajsavval kiegészítve) besugároztuk (2E3. ábra), a pH 5,9-re csökkent (ΔpH 0,4 6,3-ról kiindulva), míg 30 Gy dózis (10,8 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2F3. ábra) és 40 Gy dózis (10,8 g-L-1 vajsavval kiegészítve) (2G3. ábra) esetén a pH értékek 6 körül voltak.0 (ΔpH 0,3 6,3-tól kezdődően), illetve 5,8 (ΔpH 0,5 6,3-tól kezdődően).
A vad típusú és besugárzott sejtek aktivitásának időbeli alakulása a hozzáadott vajsavkoncentráció függvényében a fermentáció első 54 órájában. (A) A vad típusú törzsek sejtnövekedése, amelyet nem befolyásolt a butirát hozzáadása (kontrolltenyészetek). (B-D) A besugárzott törzsek sejtnövekedése (68 AMeV energia és 20, 30 és 40 Gy dózis), amelyet nem befolyásolt a butirát hozzáadása (kontroll kultúrák). (E,F) A besugárzott törzsek sejtnövekedése (114 AMeV energia és 20, 30 és 40 Gy dózisok), butirát hozzáadása nem befolyásolta (kontrolltenyészetek). ( A1-A3) A hozzáadott butirát hatása a vad típusú sejtek növekedésére. Az egyes tételes tenyészeteket kémiailag meghatározott P2-közegben végeztük (szérumos palackokban végeztük), amely glükózt (kb. 42 g-L-1) tartalmazott, és 3,6 (A1), 7,2 (A2) és 10,8 g-L-1 (A3) vajsavval egészítettük ki. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) A hozzáadott butirát hatása a besugárzott sejtek növekedésére (114 AMeV energia és 20, 30 és 40 Gy dózisok). Az egyes tételes tenyésztéseket kémiailag meghatározott P2-közegben végeztük (szérumos üvegekben végeztük), amely glükózt (kb. 42 g-L-1) tartalmazott, és amelyet 3,6 (X1), 7,2 (X2) és 10,8 g-L-1 (X3) vajsavval egészítettünk ki. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) A hozzáadott butirát hatása a besugárzott sejtek növekedésére (114 AMeV energia és 20, 30 és 40 Gy dózis). Az egyes tételes tenyésztéseket kémiailag meghatározott P2-közegben végeztük (szérumos palackokban végeztük), amely glükózt (kb. 42 g-L-1) tartalmazott, és amelyet 3,6 (X1), 7,2 (X2) és 10,8 g-L-1 (X3) vajsavval egészítettünk ki.
A pH-különbségek szabályozzák az egyes besugárzott törzseknél az oldószerképződéssel kapcsolatos időbeli váltást. Ez arra utal, hogy a vad típusú és a besugárzott törzsek kétfázisú anyagcsere-mintázatot mutattak, amelyet erősen befolyásolt a közeg pH-ja. Általános tendenciaként a sejtek kezdetben glükózt fogyasztottak a növekedés fenntartásához, és szerves savakat (butirát és acetát) termeltek és választottak ki elsődleges metabolitként (acidogenezis), ami a közeg pH-értékének csökkenését okozta, amikor ezek bizonyos szintre felhalmozódtak. A táptalaj savasságának ez a növekedése a savak képződését az oldószertermelés felé tolta el, amikor a tenyészet elérte a sejtnövekedés stacionárius fázisát (oldószerogenezis). Magas pH-nál elsősorban szerves savak képződnek, míg alacsony pH-nál az oldószertermelés serkentődik. A várakozásoknak megfelelően a metabolikus eltolódás jellege és az oldószerképződés kinetikai mintázata törzsfüggő volt, mivel a besugárzott törzsek saját genetikai és metabolikus sajátosságokkal rendelkeztek. A vajsavról korábban azt jelentették, hogy gátolja a sejtnövekedést . Az eredmények azt mutatták, hogy a vad típusú törzsekben a sejtnövekedés fokozatos gátlása következett be, és 3,6 g-L-1 feletti vajsavkoncentrációknál nem volt megfigyelhető reális növekedés. A besugárzott törzsekben azonban a sejtnövekedés fokozatos gátlása nem következett be, és 10,8 g-L-1 feletti vajsavkoncentráció esetén nem volt megfigyelhető reális növekedés.
A hozzáadott butirát hatásának részletesebb vizsgálatához a vad típusú törzsek és a besugárzott törzsek sejtnövekedési profiljait (OD mérések alapján) hasonlítottuk össze (2A1-G3. ábra) a fermentáció első 54 órájában. Érdekes módon a törzsek vajsavtoleranciája jelentősen javult, amikor a 12C6+-ion besugárzás energiáját és dózisát növelték. A C. tyrobutyricum ATCC 25755 glükóz-anyagcseréjének metabolikus útvonalait a 3. ábra mutatja. Az acetil-CoA, az acetoacetil-CoA és a butil-CoA három kulcsfontosságú köztitermék, amelyek a fermentáció szempontjából különösen érdekesek, tekintettel a különböző termékek képződésének lehetőségére az acidogenezis vagy a szolvensogenezis során. Ezek a köztitermékek fontos elágazási pontok, amelyek a metabolikus áramlást vagy a sav-, vagy az oldószerképződés felé irányítják. Az utolsó kulcsfontosságú köztes termékként a butiril-CoA indítja el a vajsav/butirát képződését. A butirátot a PTB és a BK egymást követő tevékenységei állítják elő. Mindkét enzim az acidogenezis során a legaktívabb, és specifikus aktivitásuk az oldószerogenezis során csökken, a PTB esetében kétszeresére, a Buk esetében hatszorosára. A szolvensogenezis indukálásához általában erős pH-függő aktivitás szükséges, amelynek in vitro optimuma az acidogén pH 5,5 (optimális pH 4,7 körül) és az in vivo (endogén) pH 5,5-nél nagyobb. E grafikonok összehasonlító elemzése mégis egyértelműen egy fő klasztert mutatott ki, amely a 68 AMeV-en és 40 Gy-nél besugárzott törzsekből, valamint a 114 AMeV-en és 30 és 40 Gy dózisoknál besugárzott törzsekből áll. A két csoport összességében nagyon hasonló toleranciát mutatott a növekvő butirátkoncentrációval szemben a vad típusú baktériumokkal összehasonlítva.
A Clostridium tyrobutyricum glükóz-anyagcseréjének metabolikus útjai . Az enzimek betűkkel vannak jelölve az alábbiak szerint: Laktát-dehidrogenáz; piruvát-ferdoxin-oxidoreduktáz; NADH-ferdoxin-oxidoreduktáz; NADPH-ferdoxin-oxidoreduktáz; hidrogenáz; foszfát-acetiltranszferáz (foszfotranszacetiláz); acetát-kináz; acetaldehid-dehidrogenáz; etanol-dehidrogenáz; tioláz (acetil-CoA-acetiltranszferáz); acetoacetil-CoA; acetát/butirát:CoA-transzferáz; acetoacetátdekarboxiláz; 3-hidroxil-butiril-CoA-dehidrogenáz; krotonáz; butiril-CoA-dehidrogenáz; foszfát-butil-transzferáz (foszfobutiriláz); butirát-kináz.
A 12C6+ ionbesugárzás hatása a vajsavtermelésre
A besugárzott törzsek vajsavtermelése jelentősen javult mind a végtermékkoncentráció, mind a hozam tekintetében a vad típusú törzshez képest, amint az a 4B,E ábrán látható. A nem besugárzott (vad típusú törzs, kontroll) C. tyrobutyricum kultúra glükóz-minimalizált táptalajba oltva szinte azonnal elkezdett cukrot fogyasztani, a vajsavtermelés 12-18 órával később kezdődött (4A,B ábra). Ugyanennek a 60 g-L-1 glükózt tartalmazó klosztridiumos táptalajba (CGM) beoltott kontrolltenyészetnek több mint 96 órára volt szüksége az akklimatizálódáshoz, annak ellenére, hogy a besugárzott törzsek és a vad típusú törzs fermentációját azonos körülmények között vizsgáltuk. A minimális metabolizmus és produktivitás meghosszabbodott időtartama annak köszönhető, hogy a sugárzás (különböző paraméterek) késleltette a sejtnövekedés log-fázisát (4C,F ábra). A besugárzott törzsek vajsavtoleranciája jelentősen javult, így több vajsavat tudtak termelni, ami teljes glükózhasznosítást és több mint 32 g-L-1 vajsav termelését és hasonló szintű sejtbiomasszát eredményezett. Továbbá a vajsav/kontroll arány a vad típusú törzs esetében 1,0-ról 1-re nőtt.52 a 114 AMeV-en és 40 Gy-vel besugárzott törzseknél, 1,37 a 114 AMeV-en és 30 Gy-vel besugárzott törzseknél, 1,41 a 68 AMeV-en és 40 Gy-vel besugárzott törzseknél, és 1,31 a 68 AMeV-en és 30 Gy-vel besugárzott törzseknél. Ez a tendencia azt jelzi, hogy a szén- és energiaáramlás átrendeződött a besugárzott törzsek anyagcsereútvonalaiban, ami jelentős változásokat eredményezett a különböző fermentációs termékek termelésében is. Meg kell jegyezni, hogy az ecetsavtermelés (adat nem látható) a fermentáció során sokkal hamarabb kiegyenlítődött, mint a vajsav/butirát. A fermentációk leálltak, amikor a glükózt már nem fogyasztották el a sejtek, mivel a szerves savak és a salakanyagok felhalmozódtak a levesben, ami a sejtnövekedés és más tevékenységek gátlását okozta. A besugárzott törzsek azonban toleránsabbak voltak a vajsavval szemben, amit a vad típushoz képest az ezekkel a besugárzott törzsekkel végzett fermentációk során elért sokkal magasabb végső butirátkoncentráció jelez. Ez nem teljesen meglepő; ahogy a 3. ábrán látható, a besugárzott törzsek fokozott vajsavtoleranciája a butirát PTA/AK útvonalán keresztül történő csökkent fluxusnak is tulajdonítható. Mivel a besugárzott törzsek már nem függtek a PTA/AK útvonaltól az energiatermelés és a túlélés szempontjából, kevésbé érzékenyek lettek a vajsav gátlására .
A vad típusú és a besugárzott C. tyrobutyricum sav- és biomassza szárazanyag-termelésének összehasonlítása (60 g-L-1 tartalmú) glükózon termesztett klosztridium táptalajon 37 °C-on, 5,5 és 6,0 pH-nál. (A-C) A 12C6+-ion besugárzás (68 AMeV energia és 20, 30 és 40 Gy dózis) hatása a glükózkoncentrációra, a vajsavtermelésre és a biomassza száraz tömegére. (D-F) 12C6+-ion besugárzás (114 AMeV energia és 20, 30 és 40 Gy dózis) hatása a glükózkoncentrációra, a vajsavtermelésre és a biomassza száraz tömegére. (G) A C. tyrobutyricumból származó sejtfehérjék SDS-PAGE vizsgálata. WT sáv: vad típus; 1. sáv: 68 AMeV-vel és 30 Gy dózissal besugárzott sejtek; 2. sáv: 68 AMeV-vel és 40 Gy dózissal besugárzott sejtek; 3. sáv: 114 AMeV-vel és 30 Gy dózissal besugárzott sejtek; 4. sáv: vad típus és 114 AMeV-vel és 40 Gy dózissal besugárzott sejtek; MW sáv: fehérje molekulasúly markerek.
Az acetátképződési útvonalhoz kapcsolódó enzimeket kódoló ack és pta gének indukciója jelentősen javítja a vajsavtermelést . A C. tyrobutyricum 12C6+-ion besugárzásnak való kitettségét és az ack és pta gének ebből eredő károsodását követő glükózanyagcsere fermentációs kinetikájának jobb megértése érdekében a vad típusú és a besugárzott törzsek fehérjeexpresszióját vizsgáltuk és hasonlítottuk össze. A 4G ábrán az SDS-PAGE eredmények láthatók. Az elemzés megerősítette a fehérje expresszióját (molekulatömeg, kb. 85 kDa) a négy besugárzott törzsben, a legmagasabb fehérje expressziós szint a 4. sávban volt. A 114 AMeV és 40 Gy sugárzással besugárzott törzs esetében a körülbelül 106 kDa fehérje mennyisége sokkal magasabb volt, mint a vad típusú törzs esetében. Számos mikroorganizmusból származó AK-t és PTA-t jellemeztek, de az eredmények nagy eltéréseket mutattak a molekulatömegükben . Ezért enzimaktivitási vizsgálatokat végeztünk, hogy tovább vizsgáljuk az AK, a PTA és a PTB szerepét a savképző utakban (3. ábra). A C. tyrobutyricum metabolikus szelektivitását a növekedési stádium befolyásolja, az exponenciálisan növekvő kultúrák mind vajsavat, mind ecetsavat termelnek, míg a lassabb stacionárius növekedési sebességű kultúrák inkább vajsavat termelnek . Ezért az egyes tételek logfázisú növekedése során a kultúramintákat eltávolítottuk és elemeztük a PTA, PTB és AK aktivitását a besugárzott és a vad típusú törzsekben. Megvizsgáltuk a PTA, PTB és AK specifikus enzimaktivitását a besugárzott törzsekben (különböző fizikai paraméterek), és relatív aktivitásukat összehasonlítottuk a vad típusú törzs aktivitásával. Az AK aktivitása körülbelül 47%-kal csökkent a 114 AMeV és 40 Gy sugárzással besugárzott törzseknél, 31%-kal a 114 AMeV és 30 Gy sugárzással besugárzott törzseknél és 26%-kal a 68 AMeV és 40 Gy sugárzással besugárzott törzseknél. A vad típusú törzsekhez képest a 114 AMeV és 40 Gy sugárzással besugárzott törzsek AK-aktivitása alacsonyabb volt (47%), de váratlanul magasabb PTA-aktivitást mutattak (129%), bár a PTB-aktivitás hasonló volt. Mivel a 114 AMeV-en besugárzott törzsek AK-aktivitása sokkal alacsonyabb volt, a PTA-AK útvonal károsodott, és így több butirátot (60 g-L-1) termeltek glükózból, mint a vad típusú törzsek. Mint korábban említettük, ezek a fokozódások és javulások a butirátgátlással szembeni fokozott toleranciának és bizonyos mértékig a PTA-AK útvonalon keresztül történő csökkent szénáramlásnak tulajdoníthatók, amit a besugárzott törzsek megnövekedett butirát/acetát aránya is bizonyít.
A 12C6+sugárzás hatása a C. tyrobutyricum savtermelésére és növekedésére
A C. tyrobutyricum ATCC 25755 butiráttermelő képességének meghatározása érdekében a kísérletet fermentációs üzemmódban, glükózt elsődleges szénforrásként használva végeztük el. Amint az 5A,B ábrán látható, a glükózból származó vajsavhozam jelentősen megnőtt, a vad típusú törzsek esetében 0,43 g-g-1-ről 0,56 g-g-1-re a 68 AMeV-en és 30 Gy dózisban besugárzott törzs esetében, 0.59 g-g-1 a 68 AMeV-en és 40 Gy dózisban besugárzott törzs esetében, 0,63 g-g-1 a 114 AMeV-en és 30 Gy dózisban besugárzott törzs esetében, és 0,66 g-g-1 a 114 AMeV-en és 40 Gy dózisban besugárzott törzs esetében. Megjegyzendő, hogy a 114 AMeV-en és 40 Gy dózissal besugárzott törzs butiráthozama magasabb lett volna (>0,66 g-g-1), ha a késleltetési fázis alatti glükózfogyasztást elhanyagoljuk. A 68 AMeV-en és 30 és 40 Gy dózisban besugárzott törzs által termelt ecetsav hasonló volt a vad típusból származóhoz. A 114 AMeV-en és 30 és 40 Gy dózisban besugárzott törzs által termelt ecetsav azonban csökkent a vad típushoz képest. Amint az 5B. ábrán látható, a glükózból származó ecetsavhozam is jelentősen csökkent, a vad típusú törzs esetében körülbelül 0,11 g-g-1-ről körülbelül 0,08 g-g-1-re a 114 AMeV-vel és 30 Gy-vel besugárzott törzs esetében, és körülbelül 0,07 g-g-1-re a 114 AMeV-vel és 40 Gy-vel besugárzott törzs esetében. Mindazonáltal a butirát/acetát arány (g/g) a vad típusú törzs esetében 3,99-ről 5,82-re nőtt a besugárzott törzsek esetében, ami egyértelműen jelzi, hogy a besugárzott törzsek anyagcsereútjai a vajsavtermelés javára tolódtak el az ecetsavtermeléssel szemben. Amint a 3. ábrán látható, mivel az AK és PTA aktivitás jelentősen csökkent a besugárzott törzsekben, több piruvátot kellett katabolizálni a butirát-termelő útvonalon keresztül, ami nagyobb butiráthozamot eredményezett a glükózból. Ezenkívül a vajsav is elősegíthette a savtermelő útvonalra való korábbi áttérést, ami lassabb növekedési sebességben tükröződhetett. Ugyanezen okból a besugárzott minták lassabb növekedési ütemet szenvedtek, mivel kevesebb ATP-t termeltek az acetát-termelő (PTA-AK) útvonalból, amely általában több ATP-t képes termelni a metabolizált glükóz egy moljára vetítve, mint a butirát-termelő (PTB-BK) útvonal .
A vad típusú és a besugárzott C. tyrobutyricum sejtek savtermelésének összehasonlítása. (A) A vajsav és az ecetsav termelését a vad típusú sejtek és a 68 AMeV-en és 30 és 40 Gy dózisban besugárzott sejtek lineáris diagramjainak meredekségéből becsültük. (B) A vajsav és az ecetsav termelését a vad típusú sejtek és a 114 AMeV-en és 30 és 40 Gy dózisban besugárzott sejtek lineáris diagramjainak meredekségéből becsültük. (C) A biomassza száraz tömegének időbeli kinetikus növekedési profiljainak linearizálása (integrálása) természetes logaritmus transzformációval. A vad típusú és a besugárzott sejtek maximális fajlagos növekedési sebességét a 114 AMeV-en és 40 Gy dózison besugárzott, 60 g-L-1 glükózt tartalmazó Clostridium növekedési táptalajban növesztett sejtekre megadott példa szerint számoltuk ki. BDW, biomassza száraztömeg.
Az μ max grafikonját ezután a kezdeti glükóz magas koncentrációinál (40, 60, 80 és 120 g-L-1) úgy határoztuk meg, hogy a fermentációs adatokat a modellszimulációból származó előrejelzésekhez illesztettük. A biomassza száraz tömeg (BDW) kinetikus növekedési profiljainak időbeli linearizálását (integrálását) a természetes logaritmus transzformáció alkalmazásával értük el:
Hol x(t) = BDW koncentráció minden x 0 időpontban ; t = kezdeti BDW koncentráció; μ max = maximális fajlagos növekedési sebesség (h-1); és a fajlagos növekedési sebesség μ = (1/x(t)). – (dx/dt). Az egyszerűsítés érdekében feltételeztük, hogy minden baktérium az exponenciális sejtnövekedési törvényt követi a szakaszos tenyészetben egy elsőrendű kinetikai modell szerint. A sejtek fajlagos növekedési sebessége vagy a sejttömeg időbeli növekedése a szelektivitás eltolódását jelenti különböző növekedési sebességeknél, ami jelentős hatással van a fermentációs folyamatra . A gyors sejtnövekedésnek nagyobb az energiaigénye, és előnyben részesíti az ecetsav termelését. Alacsony növekedési sebességnél az ecetsavval szemben a vajsav termelését részesítik előnyben. Folyamatos fermentáció esetén a butirát/vajsav termelés nagyobb, ha μ alacsonyabb. Amikor μ nullához közelít, a termelékenységben oszcilláció lép fel . Ezek az egyenletek lehetővé teszik a szakaszos és a folyamatos rendszerek növekedési sebességének összehasonlítását a vad típusú és a sugárzott törzseken belül.
A modell nem médiumfüggetlen: a fent leírtak szerint használt médium befolyásolja mind a sejtek növekedési sebességét, mind a termelt butirát/ vajsav mennyiségét, és az eltérő glükózfogyasztási profilok eltérő eredményeket eredményeznének. A sejtnövekedés szempontjából optimális glükózkoncentráció jobb számszerűsítése érdekében a vad típusú és a besugárzott törzsek esetében az exponenciális növekedési fázisból vett kinetikai adatokból határoztuk meg a maximális fajlagos növekedési sebességet, és ábrázoltuk a hozzáadott glükóz koncentrációjával szemben. Amint az 5C. ábrán látható, a 114 AMeV és 40 Gy dózissal besugárzott törzsek maximális fajlagos növekedési sebességét annak a példának megfelelően számoltuk ki, ahol a törzset 60 g-L-1 glükózt tartalmazó CGM közegben növesztettük. Az adatpontok legjobb lineáris tartományát választottuk ki, amely megfelel a törzs exponenciális növekedési fázisának. Néhány esetben, amikor a három kísérleti adatpont minimális követelménye nem teljesült, egy alternatív kifejezést használtunk, amely csak két szélsőséges pontot vett figyelembe (az exponenciális fázis elején és végén). Az egyenes meredeksége (m = μmax) adja a maximális fajlagos növekedési sebességet (0,213 h-1). Az egyértékű lineáris regressziós modell (y = 0,2129x – 2,6457) korrigált meghatározási együtthatója R2 = 0,9765 volt, ami azt jelzi, hogy minden adatpont a legjobban illeszkedő egyenesre került, és egyetlen adatpont sem tért el ettől az egyenestől. Ezenkívül minden egyes fajlagos növekedési sebességet a BDW és az idő függvényében készített megfelelő féllogaritmikus diagram meredekségéből becsültük meg. A hibasávok az egyes független fermentációs ismétlések számításaiból kapott standard eltérést (SD) fejezik ki a besugárzott törzsek és a vad típus esetében (az eredeti adatok nincsenek feltüntetve). Az eredmények azt mutatják, hogy ezeknek a besugárzott törzseknek a vad típushoz (μ = 0,38 ±0,03-0,21 ±0,02 h-1) képest jelentősen alacsonyabb volt a fajlagos növekedési sebessége (μ = 0,38-0,42 h-1). A 68 AMeV, 20-40 Gy és 106-108 ion-impulzus-1 12C6+-ionos besugárzás alkalmazása különösen hosszú, 10, 12 és 16 órás késleltetési fázisokat eredményezett. Összehasonlításképpen, a 114 AMeV, 20-40 Gy és 106-108 ion-impulzus-1 12C6+-ionos besugárzás alkalmazása 12, 18 és 24 órás késleltetési fázisokat eredményezett. Ezek a hosszabb lag-fázisok részben a különböző besugárzási paramétereknek és a fermentáció során alkalmazott alacsony sűrűségű beoltási mennyiségnek tulajdoníthatók. A besugárzott sejtek alacsonyabb fajlagos növekedési sebessége a nagyobb energiával és dózisokkal kiváltott károsodás miatt a glükóz-anyagcsere által termelt alacsonyabb energiamennyiség következtében a sejtekre nehezedő anyagcsere-terhelés következménye lehet. A vad típusú törzsekkel összehasonlítva a 20 és 30 Gy 68 AMeV-en besugárzott törzsek hasonló növekedési és glükózfogyasztási profillal rendelkeztek, szinte azonos fajlagos növekedési rátával μ = 0,42 ±0.03 h-1 , míg a 30 és 40 Gy-vel 114 AMeV-en besugárzott törzsek jelentősen hosszabb lag-fázist, lassabb glükózfogyasztást és sokkal alacsonyabb fajlagos növekedési sebességet mutattak: μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) és μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Amint korábban említettük, az acetát szintézise PTA és AK reakciókon keresztül történik, az utóbbi reakció ATP-t biztosít (3. ábra). A butirát bioszintéziséhez két molekula acetil-CoA kondenzálódik acetoacetil-CoA-vá, majd redukció következik butiril-CoA-vá, amely aztán PTB és BK reakciókon keresztül ATP-termeléssel butiráttá alakul. A besugárzott törzsek (114 AMeV energia és 30 és 40 Gy dózis) alacsonyabb fajlagos növekedési rátája a sejtek metabolikus terhelésének tulajdonítható, amelyet a glükóz-anyagcsere során az ack és a pta sugárzás okozta károsodása miatt kevesebb energia (ATP) termelődése okoz. A glükózból származó BDW a besugárzott törzsek esetében is különbözött a vad típusú törzsekétől. A besugárzott törzsek BDW-jének az idő és a fajlagos növekedési sebesség függvényében készített ábrája azt jelezte, hogy a szén- és energiaáramlás e törzsek anyagcsereútjain belül újraelosztásra került, ami jelentős változásokat eredményezett a fermentációs termékek savtermelésében is.