Tiocolchicoside stabilitásának vizsgálata ömlesztett és kapszulákban RP-HPTLC/Densitometria segítségével

Egyedül a tiokolkikozid meghatározására ömlesztett és gyógyszerkészítményekben egyes analitikai módszereket, például LC-ESI-MS RP-HPLC és UV-spektrofotometriás módszereket dolgoztak ki.

A tiokolkikozid számos más gyógyszerrel kombinálva is elérhető, ezért számos módszert, például UV-spektrofotometriás , RP-HPLC és HPTLC módszereket vizsgáltak a tiokolkikozid kombinált gyógyszerformákban történő meghatározására.

A Nemzetközi Harmonizációs Konferencia (ICH) “Új gyógyszerhatóanyagok és termékek stabilitásának vizsgálata” című irányelvei előírják, hogy a hatóanyag eredendő stabilitási jellemzőinek tisztázására stresszvizsgálatokat lehet végezni. Az ideális stabilitást jelző módszer az, amely a standard hatóanyagot és annak bomlástermékeit is felbontja . Ezért olyan megbízható és gyors meghatározási módszert kell kidolgozni, amellyel a bomlási komponensek optimális elválasztása is elérhető az alapvegyülettől. Tudomásunk szerint azonban a tiookolkikozid stabilitást jelző RP-HPTLC meghatározásával kapcsolatos cikk még nem jelent meg az irodalomban. A jelen dolgozatban leírt munka célja a tiookolkikozid azonosítására és mennyiségi analízisére vonatkozó feltételek meghatározása a bomlástermékei jelenlétében, az ömlesztett gyógyszer tisztaságának és az adagolási formák stabilitásának értékelése céljából. A stabilitást jelző RP-HPTLC módszer alkalmasságát a tiocolchicosid mennyiségi meghatározására az ICH irányelvek követelményeinek megfelelő validálással igazoltuk .

2. Kísérleti

2.1. Kísérleti

2.1. Vegyszerek és reagensek

A tiokolkikozidot az Ajanta Pharma cégtől kaptuk ajándék mintaként. Ltd, Mumbai, India. A HPLC minőségű metanolt, HCl-t, NaOH-t és H2O2-t az indiai Merck Chemicals-tól vásároltuk.

2.2. HPTLC műszerezés

A gyógyszerstandardot és a mintákat 6 mm széles sávok formájában pöttyöztük CAMAG Linomat mikroliteres fecskendővel (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Svájc) CAMAG Linomat 5 minta felhordó készülék (CAMAG Muttenz, Svájc) segítségével, állandó felhordási sebességgel, 150 nL/másodperc. A lemezeket metanollal előmostuk és a kromatográfia előtt 10 percig 100°C-on aktiváltuk. A kromatográfiát 60 RP-18 F254S szilikagéllel (20 × 10 cm, E. Merck, Németország) előzetesen bevont alumínium lemezeken végeztük. A lineárisan felszálló fejlesztést mozgófázisként metanol: víz (70 : 30 v/v) keverékkel végeztük egy 20 × 10 cm-es ikertálcás üvegkamrában (CAMAG Muttenz, Svájc). A mobil fázis optimális kamra telítési ideje 30 perc volt szobahőmérsékleten (28 ± 2 °C). A kromatogramfutás hossza körülbelül 80 mm volt. A lemez fejlesztési ideje 25 perc volt. A fejlesztés után a lemezeket légszárítóval levegőáramban szárítottuk. A foltok detektálását ezután 377 nm-en végeztük egy CAMAG TLC Scanner 3 készülékkel abszorbancia üzemmódban, amelyet a winCATS szoftver 1.3.0 verziója működtetett. A sugárzás forrása deutériumlámpa volt. A rés mérete 6 mm × 0,45 mm volt, a pásztázási sebesség pedig 20 mm/másodperc.

2.3. A standard törzsoldat előállítása

Standard törzsoldat 1 mg/ml tiookolkikozidból metanolban.

2.4. Linearitási vizsgálat

A 0,2 és 1,2 mL közötti standard törzsoldatot hat különálló 10 mL-es mérőlombikba töltöttük, és a térfogatot metanollal egészítettük ki. A fenti oldatok mindegyikéből 5 μL-t vittünk fel RP-HPTLC lemezekre, hogy sávonként 100 és 600 ng közötti koncentrációt kapjunk. A módszer kalibrációs diagramját a csúcsterület és a gyógyszerkoncentráció függvényében alakítottuk ki.

2,5. A mintaoldat elkészítése

A kapszula tiocolchicosid-tartalmának meghatározásához húsz kapszulát (MYORIL, címke állítás: 8 mg tiocolchicosid kapszulánként) lemértünk; a kapszulák tartalmát eltávolítottuk; és meghatároztuk az átlagtömeget. A 8 mg tiookolkikozidnak megfelelő mennyiséget 50 ml metanolt tartalmazó 100 ml-es mérőlombikba vittük át, és 10 percig szonikáztattuk; a térfogatot jelre állítottuk, és Whatmann 41-es számú szűrőpapírral szűrtük. Az 5 ml térfogatot 10 ml-re hígítottuk metanollal; az így kapott 5 μL oldatot a tiookolkikozid meghatározásához RP-HPTLC lemezre vittük. A lemezeket a fent leírtak szerint fejlesztettük és szkenneltük.

2.6. A módszer validálása

A módszert az ICH-irányelvek szerint a következő paraméterek tekintetében validáltuk.

2.6.1. Precizitás

A minta felvitelének megismételhetőségét és a csúcsterület mérését a vizsgálati koncentráció hat ismétlésével végeztük (400 ng tiocolchikozid sávonként). A tiocolchikozid becslésére vonatkozó napon belüli és napok közötti szórást három ismétléssel, három különböző koncentrációs szinten (200, 300 és 500 ng sávonként) végeztük el.

2.6.2. A napok közötti szórást három különböző koncentrációval (200, 300 és 500 ng sávonként) végeztük el. Kimutatási határ (LOD) és mennyiségi meghatározási határ (LOQ)

A kimutatási és mennyiségi meghatározási határ meghatározásához a kalibrációs görbe lineáris tartományának alsó részén lévő tiocolchicosid-koncentrációkat használtunk. A standard törzsoldatból 100, 120, 140, 160, 180 és 200 ng tiocolchicosidot sávonként három példányban alkalmaztunk RP-HPTLC lemezen, és a LOD és LOQ értékeket a következő egyenletek segítségével számoltuk ki: ahol “” a gyógyszerek csúcsterületeinek standard eltérése (), amelyet a zaj mértékeként vettünk, és “” a megfelelő kalibrációs görbe meredeksége.

2.6.3. A kalibrációs görbét a következő egyenletekkel számoltuk ki:

2.6.3. A kalibrációs görbét a következő egyenletekkel számoltuk ki. Specificitás

A módszer specificitását gyógyszerstandard és minta elemzésével ellenőriztük. A mintában a tiocolchicosid sávját a sáv értékeinek és spektrumának a gyógyszerstandardéval való összehasonlításával igazoltuk. A tiookolkikozid csúcstisztaságát a spektrumok összehasonlításával igazoltuk három különböző szinten, azaz a sáv csúcs-kezdet (), csúcs-apex () és csúcs-vég () pozícióiban.

2.6.4. A tiookolkikozid tisztasága. Robusztusság

A módszer robusztusságát úgy végeztük el, hogy két különböző analitikus 400 ng tiocolchikozidot elemzett, azonos kísérleti és környezeti feltételek megtartásával.

2.6.5. Az analízisek során az analízist két különböző analitikus végezte. Pontosság

A tiookolkikozid mintaoldat kilenc sávját (sávonként 200 ng) vittük fel a lemezre, majd ismert mennyiségű tiookolkikozidot vittünk fel három példányban a mintakoncentráció (sávonként 200 ng) 80, 100 és 120%-ában (160, 200 és 240 ng), és a javasolt módszerrel újraelemeztük. Ezt azért végeztük, hogy értékeljük a gyógyszer visszanyerési tanulmányát a készítmények különböző szintjein.

2.6.6. Robusztusság

A mobilfázis összetételének, a mobilfázis mennyiségének, az alkalmazástól a fejlesztésig eltelt időnek és a fejlesztéstől a letapogatásig eltelt időnek a mozgófázisra gyakorolt hatását kis módosításokkal vizsgáltuk. Különböző összetételű metanol: víz (72 : 28 v/v) és metanol: víz (68 : 32 v/v) mobilfázisokat próbáltunk ki, és kromatogramokat futtattunk. A lemezeket metanollal előmostuk és 80 ± 5 °C-on 2, 5 és 8 percig aktiváltuk a kromatográfiát megelőzően. A módszer robusztusságát ugyanazon folt hat ismétlésével (400 ng tiookolkikozid sávonként) végeztük el.

2.7. A tiookolkikozid kényszerített lebontása

2.7.1. Savas és bázisos hidrolízis

A pontosan lemért 10 mg tiocolokikozidot külön-külön 10 mL 1,0 M HCl, illetve 0,5 M NaOH metanolos oldatában oldottuk, és 30 percig 60°C-on, sötétben refluxáltuk, hogy elkerüljük a fény valószínű lebontó hatását. A fenti oldatokból külön-külön 1,0 ml-t vettünk, semlegesítettük és 10 ml-re hígítottuk metanollal. Az így kapott oldatokat három példányban (egyenként 5 μL, azaz sávonként 500 ng) vittük fel az RP-HPTLC lemezekre. A kromatogramokat a fent leírtak szerint fejlesztettük és szkenneltük.

2.7.2. Oxidatív lebontás

Az oxidatív lebontáshoz pontosan lemért 10 mg tioclokikozidot külön-külön 10 mL 1% v/v H2O2, illetve 3% v/v H2O2 metanolos oldatban oldottuk fel, és sötétben, szobahőmérsékleten tartottuk 30 percig. 30 perc elteltével mindkét fenti oldatból 1,0 ml-t vettünk, és 10 ml-re hígítottuk metanollal. Az így kapott oldatokat RP-HPTLC lemezekre vittük fel három példányban (egyenként 5 μL, azaz sávonként 500 ng). A kromatogramokat a fent leírtak szerint fejlesztettük és szkenneltük.

2.7.3. Száraz hővel történő lebomlás

A pontosan lemért 10 mg tiookolkikozidot 70°C-on 8 órán keresztül sütőben tároltuk. Átvittük 10 ml metanolt tartalmazó mérőlombikba, és a térfogatot jelig töltöttük fel. A fenti oldatból 1,0 mL-t vettünk, és 10 mL-re hígítottuk metanollal. Az így kapott oldatot RP-HPTLC lemezre vittük fel három példányban (egyenként 5 μL, azaz sávonként 500 ng). A kromatogramot a fent leírtak szerint fejlesztettük és szkenneltük.

2.7.4. Fényképes lebomlás

A pontosan lemért 10 mg tiocolchikozidot 10 ml metanolban oldottuk, és az oldatokat 24 órán át fényben tartottuk. A fenti oldatból megfelelő mennyiségű 1,0 mL-t vettünk, és 10 mL-re hígítottuk metanollal. Az így kapott oldatot RP-HPTLC lemezre vittük fel három példányban (egyenként 5 μL, azaz sávonként 500 ng). A kromatogramot a fent leírtak szerint fejlesztettük és szkenneltük.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. Eredmények és megbeszélés

3.1. Az optimális mobilfázis kifejlesztése

A tiookolkikozid elválasztásához megfelelő mobilfázis kiválasztásához több futtatást végeztünk különböző koncentrációjú, különböző polaritású oldószereket tartalmazó mobilfázisokkal. Az alkalmazott különböző mobilfázis-kombinációk közül a metanol: víz (70 : 30 v/v) mobilfázis éles és jól meghatározott csúcsot adott 0,60 ± 0,02 értéknél (2. ábra). A jól elkülönülő sávokat akkor találtuk, amikor a kamrát 30 percig telítettük a mobilfázissal szobahőmérsékleten.

2. ábra

A tiookolkikozid standard ( 0,60 ± 0,02) kromatogramja 377 nm-en metanol: víz (70 : 30 v/v) mint mozgófázisban.

3.2. Kalibrációs görbe

A kalibrációs görbék () lineáris regressziós adatai jó lineáris kapcsolatot mutattak a 100-600 ng/sáv koncentrációtartományban. A lineáris regressziós egyenletet , = 0,9984-nek találtuk (3. ábra).

3. ábra

A tiookolkozid kalibrációs görbéje (100-600 ng sávonként).