U.S. Food and Drug Administration

July 2000

Toxikológiai alapelvek az élelmiszer-összetevők biztonsági értékeléséhezRedbook 2000Chapter IV.C.1..d. Emlősök eritrocitáinak mikronukleusz-tesztje

Vissza a Redbook 2000 tartalomjegyzékhez

I. Bevezetés

A mikronukleuszok citoplazmatikus kromatint tartalmazó testek, amelyek akkor keletkeznek, amikor az anafázis során akcentrikus kromoszómatöredékek vagy kromoszómák elmaradnak, és a sejtosztódás során nem épülnek be a leánysejtmagokba. Mivel a kromoszómatöréseket, szerkezetileg abnormális kromoszómákat vagy orsórendellenességeket eredményező genetikai károsodás mikronukleuszok kialakulásához vezet, a mikronukleuszok előfordulása az ilyen típusú károsodások indexeként szolgál. Megállapították, hogy lényegében minden olyan ágens, amely kettős szálú kromoszómatörést okoz (klasztogének), mikronukleuszokat indukál. Mivel a mikronukleuszok megszámlálása sokkal gyorsabb és technikailag kevésbé igényes, mint a kromoszóma-rendellenességek pontozása, és mivel a mikronukleuszok a genetikai károsodás két fontos típusából (klasztogenezis és orsószakadás) erednek, a mikronukleusz-tesztet széles körben használják az ilyen típusú károsodást okozó vegyi anyagok szűrésére.

Ez az útmutató a legszélesebb körben használt in vivo mikronukleusz-teszttel foglalkozik: az emlősök eritrocita-mikronukleusz-tesztjével. Ezt az in vivo mikronukleusz vizsgálatot a vizsgált anyag által az eritroblasztok kromoszómáiban vagy mitotikus apparátusában okozott károsodás kimutatására használják az állatok, általában rágcsálók csontvelőjéből és/vagy perifériás vérsejtjeiből vett eritrociták elemzésével.

A mikronukleusz-teszt célja olyan anyagok azonosítása, amelyek olyan citogenetikai károsodást okoznak, amely lemaradó kromoszómatöredékeket vagy egész kromoszómákat tartalmazó mikronukleuszok képződését eredményezi.

Amikor egy csontvelői eritroblaszt polikromatikus eritrocitává fejlődik, a fő sejtmag kilép; a képződött mikronukleuszok az egyébként enukleált citoplazmában visszamaradhatnak. A mikronukleuszok láthatóvá tétele megkönnyíti ezekben a sejtekben a specifikus festési technikák alkalmazását, és mivel hiányzik a főmagjuk. A mikronukleált polikromatikus eritrociták gyakoriságának növekedése a kezelt állatokban az indukált kromoszómakárosodásra utal.

II. Definíciók

A centroméra (kinetochore) a kromoszóma olyan régiója(i), amely(ek)hez a sejtosztódás során orsórostok kapcsolódnak, lehetővé téve a leánykromoszómák rendezett mozgását a leánysejtek pólusai felé.

A mikronukleuszok a sejtek főmagjától elkülönülő és azt kiegészítő kis sejtmagok, amelyek a mitózis (meiózis) télofázisában keletkeznek lemaradó kromoszómatöredékekből vagy egész kromoszómákból.

A normokromatikus eritrocita olyan érett eritrocita, amelyből hiányoznak a riboszómák, és amelyet riboszómákra szelektív festékekkel lehet megkülönböztetni az éretlen, polikromatikus eritrocitáktól.

A polikromatikus eritrocita a fejlődés köztes szakaszában lévő éretlen eritrocita, amely még riboszómákat tartalmaz, és ezért a riboszómákra szelektív festékekkel megkülönböztethető az érett, normokromatikus eritrocitáktól.

III. Kezdeti megfontolások

A rágcsálók csontvelőjét rutinszerűen használják ebben a vizsgálatban, mivel a polikromatikus eritrociták ebben a szövetben termelődnek. A mikronukleált éretlen (polikromatikus) eritrociták mérése a perifériás vérben ugyanúgy elfogadható bármely olyan fajnál, amelynél bizonyítottan a lép nem képes eltávolítani a mikronukleált eritrocitákat, vagy amely megfelelő érzékenységet mutat a strukturális és/vagy numerikus kromoszóma-rendellenességeket okozó anyagok kimutatására. A mikronukleuszokat számos kritérium alapján lehet megkülönböztetni. Ezek közé tartozik a kinetokór vagy centromerikus DNS jelenlétének vagy hiányának azonosítása a mikronukleuszokban. A mikronukleált éretlen (polikromatikus) eritrociták gyakorisága a fő végpont. Az érett (normokromatikus) eritrociták száma a perifériás vérben, amely adott számú érett eritrocita közül mikronukleuszokat tartalmaz, szintén használható a vizsgálat végpontjaként, ha az állatokat folyamatosan kezelik olyan ideig, amely meghaladja az eritrocita élettartamát a vizsgált fajban (pl. 4 hét egérnél), feltéve, hogy az adott fajban/törzsben nem történik jelentős lépszelekció a mikronukleált eritrocitákkal szemben. A lépszelekció következményeivel, ha az előfordul, teljes mértékben foglalkozni kell.

Ez az emlősökön végzett in vivo mikronukleusz teszt különösen fontos a mutagén veszély értékeléséhez, mivel lehetővé teszi az in vivo metabolizmus, farmakokinetika és DNS-javítási folyamatok tényezőinek figyelembevételét, bár ezek fajonként, szövetenként és genetikai végpontonként eltérőek lehetnek. Az in vivo vizsgálat hasznos az in vitro rendszerrel kimutatott mutagén hatás további vizsgálatához is.

Ha bizonyíték van arra, hogy a vizsgált anyag vagy egy reaktív metabolit nem éri el a célszövetet, akkor nem célszerű ezt a vizsgálatot alkalmazni.

IV. A vizsgálati módszer elve

Az állatokat megfelelő úton teszik ki a vizsgált anyagnak. Ha csontvelőt használunk, az állatokat a kezelés után megfelelő időpontokban feláldozzuk, a csontvelőt kivonjuk, preparátumokat készítünk és megfestjük.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Ha perifériás vért használunk, a kezelést követően megfelelő időpontokban levesszük a vért, kenetkészítményeket készítünk és megfestjük.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) A preparátumokat elemezzük a mikronukleák jelenlétére.

V. A módszer leírása

A. Preparátumok

1. Az állatfajok kiválasztása

Történetileg egereket vagy patkányokat használtak rutinszerűen ehhez a vizsgálathoz. Ha a csontvelő a mintavételezett szövet, bármely megfelelő emlősfaj használható (lásd a fenti III. szakaszt). Mint minden toxikológiai vizsgálat esetében, a megfelelő faj kiválasztását meg kell indokolni. Ha perifériás vért használnak, egerek használata ajánlott. Azonban bármely megfelelő emlősfaj használható, feltéve, hogy olyan fajról van szó, amelynek lépéből nem távolítják el a mikronukleált eritrocitákat, vagy olyan fajról, amely megfelelő érzékenységet mutatott a strukturális és/vagy numerikus kromoszóma-rendellenességeket okozó anyagok kimutatására. Fiatal, egészséges állatok általánosan használt laboratóriumi törzseit kell alkalmazni. A vizsgálat megkezdésekor az állatok súlyának eltérése minimális legyen, és ne haladja meg az egyes nemek átlagsúlyának ±20%-át.

2. Tartási és takarmányozási körülmények

A kísérleti állatkísérleti helyiség hőmérsékletének meg kell felelnie az alkalmazott fajnak; egerek és patkányok esetében ennek 22°C (±3°C) kell lennie. Bár a relatív páratartalomnak legalább 30%-osnak kell lennie, és lehetőleg nem haladhatja meg a 70%-ot, kivéve a helyiség takarításakor, a cél az 50-60%. A megvilágításnak mesterségesnek kell lennie, a sorrend 12 óra világos, 12 óra sötét. A takarmányozáshoz hagyományos laboratóriumi tápok használhatók, korlátlan mennyiségű ivóvízzel. A táp kiválasztását befolyásolhatja az, hogy biztosítani kell a vizsgált anyag megfelelő adagolását, ha ezen az úton adják be. Az állatok elhelyezhetők egyedileg, vagy azonos nemű kis csoportokban ketrecben.

3. Az állatok előkészítése

Egészséges fiatal felnőtt állatokat kell véletlenszerűen a kontroll- és a kezelési csoportokhoz rendelni. Az állatokat egyedileg kell azonosítani. Az állatokat legalább öt napig kell akklimatizálni a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elhelyezni, hogy a ketrec elhelyezéséből adódó lehetséges hatások a lehető legkisebbek legyenek.

4. Az adagok elkészítése

A szilárd vizsgálati anyagokat megfelelő oldószerekben vagy hordozókban kell feloldani vagy szuszpendálni, és adott esetben az állatok adagolása előtt hígítani kell. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül adagolhatók vagy az adagolás előtt hígíthatók. A vizsgált anyag friss készítményeit kell alkalmazni, kivéve, ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát.

B. Vizsgálati feltételek

1. Oldószer/Vivőanyag

Az oldószer/vivőanyag nem okozhat toxikus hatást az alkalmazott dózisszinteken, és nem állhat fenn a gyanú, hogy kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal. Ha az általánosan használt oldószerektől/vivőanyagoktól eltérő oldószereket/vivőanyagokat használnak, használatukat olyan referenciaadatokkal kell alátámasztani, amelyek jelzik a vizsgált anyaggal és az állatokkal való kompatibilitásukat. Javasoljuk, hogy adott esetben először a vizes oldószer/vivőanyag használatát mérlegeljék.

2. Kontrollok

A rágcsálókkal végzett minden egyes vizsgálatban általában minden nemnél egyidejűleg pozitív és negatív (oldószer/vivőanyag) kontrollt kell alkalmazni. Ha azonban a mikronukleusz vizsgálatot egy általános toxicitási vizsgálat részeként végzik a GLP-irányelveknek megfelelően, akkor a megfelelő adagolás ellenőrzését kémiai elemzéssel kell elvégezni. Ilyen esetekben nem feltétlenül szükséges az állatok egyidejű kezelése pozitív ellenőrző szerrel, és a festési és pontozási eljárások ellenőrzése elvégezhető olyan megfelelő referenciaminták bevonásával, amelyeket korábban olyan állatokból nyertek, amelyek nem részei a jelenlegi kísérletnek. Magasabb rendű fajokkal, például főemlősökkel vagy kutyákkal végzett vizsgálatokban a pozitív kontrollok elhagyhatók, feltéve, hogy a vizsgáló laboratórium korábban bizonyította a felhasznált faj pozitív kontrollanyagaira adott elfogadható választ. Az egyidejű negatív kontrollok minden esetben kötelező vizsgálati elemet képeznek. A vizsgált anyaggal történő kezelés kivételével a kontrollcsoportok állatait a kezelési csoportok állataival azonos módon kell kezelni.

A pozitív kontrolloknak in vivo mikronukleákat kell termelniük olyan expozíciós szinteken, amelyek várhatóan kimutatható, statisztikailag szignifikáns növekedést eredményeznek a háttérhez képest. A pozitív kontroll dózisokat úgy kell megválasztani, hogy a hatások egyértelműek legyenek, de ne fedjék fel azonnal a kódolt tárgylemezek azonosságát az olvasó számára. Elfogadható, hogy a pozitív kontrollt a vizsgált anyagtól eltérő módon adják be, és csak egyetlen alkalommal vegyenek mintát. Ezen túlmenően, ha rendelkezésre állnak, megfontolható a kémiai osztályhoz kapcsolódó pozitív kontrollkémiai anyagok használata is. Példák a pozitív kontroll anyagokra:

Negatív kontroll állatok, amelyeket kizárólag oldószerrel vagy hordozóanyaggal kezeltek, és egyébként ugyanúgy kezeltek, mint a kezelt csoportokat, minden mintavételi időpontra be kell vonni, kivéve, hogy megfelelő körülmények között lehetséges lehet egy állatot saját kontrollként használni a kezelés előtti és utáni minták összehasonlításával. Ha a negatív kontrollok esetében egyszeri mintavételt alkalmaznak, a választott mintavételi időpontot meg kell indokolni. Ezenkívül kezeletlen kontrollokat is alkalmazni kell, kivéve, ha a) a vizsgálati laboratóriumból rendelkezésre állnak adatok, vagy b) olyan korábbi vagy közzétett kontrolladatok, amelyek bizonyítják, hogy a választott oldószer/jármű nem vált ki káros vagy mutagén hatásokat.

Ha perifériás vért használnak, a kezelés előtti minta is elfogadható egyidejű negatív kontrollként, de csak a rövid perifériás vérvizsgálatokban (pl., 1-3 kezelés(ek)), ha a kapott adatok az előzménykontrolltól elvárt tartományba esnek, és ha az oldószerhatás hiánya bizonyított.

VI. Eljárás patkányok és egerek esetében

A következő szakaszok útmutatást nyújtanak az egereken és patkányokon, az ebben a vizsgálatban leggyakrabban használt fajokon végzett eljárásokhoz.

A. Az állatok száma és neme

Minden kezelt és kontrollcsoportnak nemenként legalább 5 elemezhető állatot kell tartalmaznia.(12) Ha a vizsgálat időpontjában ugyanazon fajon és ugyanazon expozíciós úton végzett vizsgálatokból származó adatok állnak rendelkezésre, amelyek azt mutatják, hogy a toxicitásban nincsenek lényeges különbségek a nemek között, akkor elegendő egyetlen nemen végezni a vizsgálatot.

B. Kezelési ütemezés

Sokféle kezelési ütemezés (azaz 1, 2 vagy több kezelés 24 órás időközönként) ajánlható. A hosszabb adagolási sémákból származó minták mindaddig elfogadhatóak, amíg a pozitív hatást bizonyították erre a vizsgálatra, vagy negatív vizsgálat esetén, amíg a toxicitást bizonyították, vagy a határdózist (lásd alább a “D” szakaszt) alkalmazták, és az adagolást a mintavétel időpontjáig folytatták. Ez olyan vizsgálatokon alapul, amelyek azt mutatják, hogy az egerek és patkányok akár szubkrónikus időtartamú ismételt expozíciója a hagyományos akut vizsgálat során kapott hatásokhoz hasonló nagyságrendű hatásokat eredményezett.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Mivel azonban bizonyos aggodalomra ad okot, hogy a hosszabb távú vizsgálatokban az érzékenység csökkenhet a valódi MTD elérésének elmaradása miatt, vagy mert adaptáció következhet be, jelenleg úgy vélik, hogy a kezelés időtartamát négy hétre kell korlátozni, amíg a vizsgálat érzékenységét hosszabb kezelés esetén meg nem erősítik.(12)

A vizsgált anyagokat osztott dózisban is be lehet adni, azaz, két vagy több kezelés ugyanazon a napon, legfeljebb néhány óra különbséggel, hogy megkönnyítsék a nagy mennyiségű anyag beadását, vagy hogy minimalizálják a vizsgálati anyag vérszintjének ingadozását.

A vizsgálat kétféleképpen végezhető:

• Az állatokat egyszer vagy kétszer kezelik a vizsgálati anyaggal, legfeljebb 24 órás időközzel. A csontvelőből legalább kétszer veszünk mintát az utolsó adagot követő 24 és 48 óra között, a minták közötti megfelelő időköz(ök)ben. A kezelést követő 24 óránál korábbi mintavételi időpontok alkalmazását indokolni kell. A perifériás vérből legalább kétszer kell mintát venni az utolsó kezelést követő 36 és 72 óra között, a minták közötti megfelelő időköz(ök)ben. Ha egy mintavételi időpontban pozitív választ észlelnek, további mintavételre nincs szükség.
• Három vagy több napi kezelés alkalmazása esetén (pl. három vagy több kezelés 24 órás időközönként), a csontvelő esetében az utolsó kezelést követően legkésőbb 24 órán belül egyszer, a perifériás vér esetében pedig legkésőbb 40 órán belül egyszer lehet mintát venni.(12), (20)

Megfelelő és tudományosan indokolt esetben további mintavételi időpontok is alkalmazhatók.

C. Dózisszintek

Ha dózistartományt megállapító vizsgálatot végeznek, mert nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok, akkor azt ugyanabban a laboratóriumban kell elvégezni, ugyanazzal a fajjal, törzzsel, nemmel és kezelési renddel, mint amit a fő vizsgálatban használnak.(7) Toxicitás esetén három dózisszintet kell használni az első mintavételi időre.(7). Ezeknek a dózisszinteknek az egyértelmű toxicitástól a kevés vagy semmilyen toxicitásig terjedő tartományt kell lefedniük. A későbbi mintavételi időpontban csak a legmagasabb dózist kell használni. A legmagasabb dózis az a dózis, amely a toxicitás jeleit okozza, és amelynél magasabb dózisszintek – ugyanazon adagolási séma alapján – várhatóan halálos kimenetelűek lennének. Az alacsony, nem toxikus dózisokban specifikus biológiai aktivitású anyagok (például hormonok és mitogének) kivételt képezhetnek a dózismeghatározási kritériumok alól, és azokat eseti alapon kell értékelni. A legmagasabb dózist úgy is meg lehet határozni, mint olyan dózist, amely a csontvelő toxicitására utaló jeleket eredményez (pl. az éretlen eritrociták arányának csökkenése az összes eritrocita között a csontvelőben vagy a perifériás vérben).

D. Határértékvizsgálat

Ha egyetlen, legalább 2000 mg/testtömegkilogramm dózisszintet tartalmazó kezelés, vagy ugyanazon a napon végzett két kezelés nem eredményez megfigyelhető toxikus hatást, és ha a genotoxicitás nem várható a szerkezetileg rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján, akkor nem szükséges a 3 dózisszintet alkalmazó teljes vizsgálat. Hosszabb időtartamú vizsgálatok esetén a határdózis 2000 mg/kg/testtömeg/nap a legfeljebb 14 napos kezelés esetén, és 1000 mg/kg/testtömeg/nap a 14 napnál hosszabb kezelés esetén. A várható emberi expozíció jelezheti, hogy a határértékvizsgálatban magasabb dózisszintet kell alkalmazni.

E. A dózisok beadása

A vizsgált anyagot általában gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanül segítségével, vagy intraperitoneális injekcióval adják be. Más expozíciós módok is elfogadhatók, ha azok indokoltak. Az egyszerre fecskendővel vagy injekcióval beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretétől függ. A mennyiség nem haladhatja meg a 2 ml/100 g testsúlyt. Az ennél nagyobb mennyiségek használatát indokolni kell. Az irritáló vagy maró hatású anyagok kivételével, amelyek általában nagyobb koncentrációknál súlyosbodó hatásokat mutatnak, a vizsgálati térfogat változékonyságát minimalizálni kell a koncentráció beállításával, hogy minden dózisszintnél állandó térfogatot biztosítsunk.

F. Csontvelő/vér előkészítése

A csontvelősejteket általában a combcsontokból vagy a sípcsontokból nyerik közvetlenül az áldozathozatal után. A sejteket általában a combcsontokból vagy sípcsontokból veszik ki, előkészítik és megfestik a bevált módszerekkel. A perifériás vért a farokvénából vagy más megfelelő érből nyerik. A vérsejteket azonnal szupravitálisan megfestik(4),(5),(14) vagy kenetkészítményeket készítenek, majd megfestik. DNS-specifikus festék (pl. akridin-narancs(15) vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y(30)) használata kiküszöbölheti a nem DNS-specifikus festék használatához kapcsolódó műtermékek egy részét. Ez az előny nem zárja ki a hagyományos festékek (pl. Giemsa) használatát. További rendszerek (pl, cellulózoszlopok a nukleált sejtek eltávolítására(36)) is használhatók, feltéve, hogy ezek a rendszerek a laboratóriumban megfelelően működnek a mikronukleuszok preparálására.

G. Elemzés

Az éretlenek arányát az összes (éretlen + érett) eritrocita között minden egyes állat esetében úgy kell meghatározni, hogy csontvelő esetében összesen legalább 200 eritrocitát, perifériás vér esetében pedig 1000 eritrocitát kell megszámolni.(9) Minden tárgylemezt, beleértve a pozitív és negatív kontrollokét is, a mikroszkópos elemzés előtt egymástól függetlenül kódolni kell. Állatonként legalább 2000 éretlen eritrocitát kell pontozni a mikronukleált éretlen eritrociták előfordulása szempontjából. További információ nyerhető az érett eritrociták mikronukleuszok szempontjából történő pontozásával. A tárgylemezek elemzése során az éretlen eritrociták aránya az összes eritrocitán belül nem lehet kevesebb, mint a kontrollérték 20%-a. Ha az állatokat 4 héten keresztül vagy annál hosszabb ideig folyamatosan kezelik, akkor állatonként legalább 2000 érett eritrocitát is lehet pontozni a mikronukleusok előfordulása szempontjából. Az automatizált elemzésre szolgáló rendszerek (képelemzés vagy a sejtszuszpenziók áramlási citometriai elemzése) elfogadható alternatívái a kézi értékelésnek, ha megfelelően indokoltak és validáltak a klasszikus mikroszkópos pontozáshoz képest.(12)

VII. Eljárás a patkányokon és egereken kívüli fajok esetében

Egereken, patkányokon, hörcsögökön, sertéseken, kutyákon, főemlősökön és embereken végzett vizsgálatokon alapuló közzétett információk(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) azt jelzik, hogy a mikronukleált eritrociták spontán és indukált gyakorisága hasonló a legtöbb emlősfajban, és azt sugallják, hogy a csontvelőben a mikronukleált éretlen eritrociták előfordulásának mérése alkalmas a kromoszóma- vagy orsókárosodás értékelésére az eddig vizsgált fajoknál. A mikronukleált eritrociták megjelenése és eltűnése a csontvelőben az egyes fajok eritrogenezisének kinetikájától és az eritrociták élettartamától függ, ezért az adagolási és mintavételi rendet az egyes fajok eritrocitakinetikájának megfelelő paraméterei szerint kell módosítani. Az egereken és patkányokon kívül más fajok is használhatók, ha szükséges, de a következő információkat kell feltüntetni:

• A kiválasztott faj, valamint az alkalmazott adagolási és mintavételi sémák indoklása az erythropoiesis kinetikájával és az erythrocyták élettartamával kapcsolatban az alkalmazott fajban;
• bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a spontán mikronukleuszok gyakorisága összhangban van a közzétett információkkal és/vagy következetes a vizsgálatot végző laboratóriumban;
• bizonyíték arra, hogy az ismert genotoxikus anyagok a felhasznált fajokban a mikronukleuszok gyakoriságának növekedését okozzák, valamint referenciaértékek a kiváltott válasz nagyságára vonatkozóan;
• a mikronukleált sejtek perifériás vérből történő szelektív eltávolításának hatása a lépre (ha ez utóbbi szolgál a megfigyelt szövetként).

VIII. Adatok és jelentéstétel

A. Kezelési eredmények

Az egyes állatok adatait táblázatos formában kell bemutatni. A kísérleti egység az állat. Az értékelt éretlen eritrociták számát, a mikronukleált éretlen eritrociták számát és az éretlenek számát az összes eritrocita között minden egyes elemzett állatra külön-külön kell felsorolni. Ha az állatokat 4 héten keresztül vagy annál hosszabb ideig folyamatosan kezelik, az érett eritrocitákra vonatkozó adatokat is meg kell adni, ha azokat összegyűjtötték. Minden egyes állat esetében meg kell adni az éretlen erythrociták arányát az összes erythrocita között, és ha alkalmazható, a mikronukleált érett erythrociták százalékos arányát. Ha nincs bizonyíték a nemek közötti válaszkülönbségre, a statisztikai elemzéshez a két nem adatait össze lehet vonni.

B. Az eredmények értékelése és értelmezése

A pozitív eredmény meghatározására számos kritérium létezik, mint például a mikronukleált sejtek számának dózisfüggő növekedése vagy a mikronukleált sejtek számának egyértelmű növekedése egyetlen dóziscsoportban, egyetlen mintavételi időpontban. A vizsgálati eredmények értékelésére statisztikai módszereket kell alkalmazni.(24),(35) A pozitív, negatív vagy kétes eredmény statisztikai kritériumait egyértelműen fel kell tüntetni a protokollban. Mivel biológiai tényezők módosíthatják az értelmezést, a statisztikai szignifikancia nem lehet a következtetés levonásának egyetlen meghatározó tényezője. Az egyértelmű eredményeket további vizsgálatokkal kell tisztázni, adott esetben a kísérleti körülmények módosításával.

Bár a legtöbb kísérlet egyértelműen pozitív vagy negatív eredményt ad, ritka esetekben az adatsor kizárja, hogy a vizsgált anyag aktivitásáról határozott ítéletet lehessen hozni. Az eredmények a kísérlet megismétlésének számától függetlenül kétértelműek vagy megkérdőjelezhetőek maradhatnak.

A mikronukleusz-teszt pozitív eredményei azt jelzik, hogy egy anyag mikronukleuszokat idéz elő, amelyek a kromoszómakárosodás vagy a mitotikus apparátus károsodásának eredményei a vizsgált faj eritroblastjaiban. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények között a vizsgált anyag nem okoz kromoszóma- vagy orsókárosodást, ami a vizsgált faj éretlen eritrocitáiban mikronukleuszok kialakulásához vezet.

Azt a valószínűséget, hogy a vizsgált anyag vagy annak metabolitjai az általános keringésbe vagy kifejezetten a célszövetbe jutnak (pl. szisztémás toxicitás), meg kell vitatni. A megfelelő célszöveti expozíció bizonyítása a negatív mikronukleusz vizsgálatban különösen fontos szempont, ha egy vagy több más vizsgálati rendszerben pozitív bizonyíték van a genotoxicitásra.

C. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek a következő információkat is tartalmaznia kell:

1. Vizsgálati anyag

• azonosító adatok és CAS-szám, ha ismert
• fizikai jellege és tisztasága
• fizikai-kémiai tulajdonságai, amelyek a vizsgálat elvégzése szempontjából fontosak
• a vizsgált anyag stabilitása, ha ismert

2. Oldószer/Vivőanyag

• a vivőanyag kiválasztásának indoklása
• a vizsgált anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/vivőanyagban, ha ismert

3. Adagoló oldatok

• az adagoló oldatok elkészítésének és felhasználásának időpontja (vagy az elkészítés és a felhasználás közötti időköz), valamint a tárolási körülmények
• az adagoló oldat koncentrációját igazoló adatok, ha rendelkezésre állnak

4. Vizsgálati állatok

• használt fajok/törzsek, beleértve az indoklást
• az állatok száma, kora és neme
• forrás, tartási körülmények, étrend stb.
• az állatok egyéni súlya a vizsgálat kezdetén, beleértve a testsúlytartományt, az egyes csoportok átlagát és standard eltérését
• információ a lépszelekciónak a perifériás vérben lévő mikronukleált sejtek előfordulására gyakorolt lehetséges hatásáról, ha alkalmazható

5. Vizsgálati körülmények

• pozitív és negatív (hordozó/oldószer) kontrolladatok
• adatok a tartománymeghatározó vizsgálatból, ha végezték
• a dózisszint kiválasztásának indoklása
• a vizsgált anyag előállításának részletei
• a vizsgált anyag beadásának részletei
• a beadási útvonal és az adagolási rend indoklása
• módszerek annak igazolására, hogy a vizsgált anyag eljutott az általános keringésbe és/vagy a célszövetbe, adott esetben
• átváltás az étrendben/ivóvízben lévő vizsgált anyag koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/testtömeg-kilogramm/nap), adott esetben
• az élelmiszer és a víz minőségének részletei
• a kezelési és mintavételi ütemterv részletes leírása
• a tárgylemezkészítés módszerei
• a toxicitás mérésének módszerei
• a mikronukleált éretlen eritrociták pontozásának kritériumai és, ha szükséges és alkalmazható, érett eritrociták
• állatonként elemzett sejtek száma
• kritériumok a vizsgálatok pozitívnak, negatívnak vagy kétes eredményűnek minősítésére

6. Eredmények

• toxicitás jelei
• éretlen eritrociták aránya az összes eritrocita között
• mikronukleált éretlen eritrociták száma az összes éretlen eritrocita között, minden egyes állatra külön megadva
• ha megfelelő és alkalmazható, mikronukleált érett eritrociták száma az összes érett eritrocita között, a mikronukleált éretlen és adott esetben érett eritrociták átlaga ± standard eltérése csoportonként
• dózis-válasz kapcsolat, ahol lehetséges
• statisztikai elemzések és az alkalmazott módszer indoklása, megfelelő irodalmi hivatkozással
• egyidejű és korábbi negatív kontroll adatok
• egyidejű és korábbi pozitív kontroll adatok

7. Az eredmények megvitatása

8. Következtetés

XI. Kiegészítés: Az akcentrikus töredékekből vs. centromerikus kromoszómákból származó mikronukleuszok azonosítása

Mikronukleuszok keletkezhetnek a mitózisban elmaradó akcentrikus töredékekből vagy teljes kromoszómákból. Ez utóbbi mikronukleuszokat először nagy méretükről,(49) C-kötéssel(47) vagy a DNS-tartalom mérésével ismerték fel(46) Ezek a módszerek azonban nem voltak túl megbízhatóak. Ezért két molekuláris citogenetikai módszert fejlesztettek ki a centromerek jelenlétének azonosítására a mikronukleuszokban, és ezáltal a klasztogén és aneugenikus eredetű mikronukleuszok megkülönböztetésére:(12) 1) immunfluoreszcens CREST-festés és 2) fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) pancentromer DNS-probákkal. Ha mechanisztikailag fontos a kinetokór vagy a centromér jelenlétének meghatározása a mikronukleuszokban, akkor ezek a módszerek alkalmazhatók.

A csontvelői mikronukleuszvizsgálatra alkalmazott CREST-módszert Miller és Adler részletesen leírja.33) A tárgylemezeken lévő sejteket (normál csontvelő kenetek) fixálják, dehidratálják, két lépésben SDS-szel és Triton-X-szel inkubálják, majd ellenanyaggal festik. A DNS-t Hoechst 33258-mal ellenfestik.

A FISH során a centromerhez közel hibridizáló minor satellite DNS-szondát(43) használják a centromerikus régió azonosítására, ha van ilyen. A centromerikus DNS-szondákkal végzett FISH módszerét Pinkel és munkatársai írták le(34) Ez a módszer alkalmazható áramlással válogatott, mikronukleit tartalmazó eritrociták(10) vagy perifériás vérmintákból nyert izolált mikronukleinek esetében.(13)

A kontroll tárgylemezeken a centromerikus régiót tartalmazó jelölt mikronukleinek aránya kb. 50%.(43) Az ismert aneogének (kolhicin és vinblastin) által indukált mikronukleinek kb. 70%-a jelölt,(33) míg a klastogének (hidrokinon és mitomicin C) által indukáltak csak 5-15%-ban mutatnak jelölt mikronukleit.(33) Egy vegyszer relatív klasztogén vs. aneugenikus aktivitásának jellemzésére hasznos indexként a centromer régiót tartalmazó polikromatikus eritrociták 1000 polikromatikus eritrocitára jutó mikronukleált polikromatikus eritrociták számát használni.(42)

Az eddig leírt FISH módszerek fő hiányossága, hogy nem tesznek különbséget a normokromatikus és polikromatikus eritrociták között.(12) Így csak olyan készítmények alkalmasak elemzésre, amelyekben a jelen lévő mikronukleuszok nagy részét a vizsgálati tárgy indukálja. Például a felnőtt állatokon végzett akut expozíciós kísérletekből származó perifériás vérminták lényegében soha nem alkalmasak elemzésre, mivel a célsejtpopuláció (éretlen eritrociták) a mintában lévő eritrocitáknak csak 3-5%-át teszi ki.

Végeredményben a CREST- vagy FISH-jelölés megbízható módszernek tekinthető a vegyi anyagok aneugenikus tulajdonságainak kimutatására az in vivo mikronukleuszvizsgálatban, feltéve, hogy figyelmet fordítanak arra, hogy megfelelő mintákat használjanak az elemzéshez. 12) A jelenlegi módszerek bonyolultsága azonban korlátozza alkalmazásukat azokra az esetekre, amikor egy vegyi anyag gyaníthatóan orsókárosodást okoz (pl., nagyméretű mikronukleuszok jelenléte, poliploidia indukciója stb. miatt), vagy ha más konkrét okok miatt van szükség e mechanisztikus információ megszerzésére.

X. Hivatkozások

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). A mu-PIM-1 transzgénikus egerek perifériás vérében 2-Acetilamino-fluorénnel vagy benzollal, de nem Diethylnitrosaminnal vagy 1,2-Diklóretánnal történő krónikus orális kezeléssel kiváltott mikronukleusok. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Mikronukleuszok indukciója benzol által B6C3F1 egerekben: Az NTP Carcinogenesis Bioassay perifériás vérkenetek retrospektív elemzése. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. és Book, S.A. (1989). Primate Micronucleus Study of L-Selenomethionine. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus teszt egér perifériás vér eritrocitákkal Acridine Orange szupravitális festéssel: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). A rövid távú egér perifériás vér mikronukleusz teszthez ajánlott protokoll. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. és MacGregor, J.T. (1988). A marginális folsavhiány és a fokozott humán kromoszómakárosodás kapcsolata in vivo: bizonyítás mikronukleált eritrociták elemzésével. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. és Richold, M. (1992). A Brit Toxikológiai Társaság/UK Környezeti Mutagén Társaság munkacsoportjának jelentése: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). Az in vivo patkány mikronukleusz teszt: Integráció egy 14 napos vizsgálattal. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. és McFadden, L.G. (1995). Mintavételi méret a polikromatikus és normokromatikus eritrociták arányának becsléséhez a csontvelő mikronukleusz tesztben. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. és Adler I.-D. (1997). A mikronukleusz indukció mennyiségi és minőségi vizsgálata egér eritrocitákban áramlási citometriával: I. Az ismert és feltételezett genotoxicitású vegyi anyagok által a perifériás vér polikromatikus eritrocitáiban okozott mikronukleusz indukció mérése. Mutagenesis 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). A rágcsálók hosszú távú mikronukleusz vizsgálatának értékelése: A CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. és Sutou, S. (2000). In vivo rágcsálók eritrocitáinak mikronukleusz-tesztje: II. A protokolltervezés néhány szempontja, beleértve az ismételt kezeléseket, a toxicitási vizsgálatokkal való integrációt és az automatizált pontozást. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Mikronukleuszok izolálása egérvérből, fluoreszcens in situ hibridizáció egér centromerikus DNS-szondával. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1990). A mikronukleusz-teszt egér perifériás vér retikulocitákkal, akridin-narancs bevonatú tárgylemezek felhasználásával. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983). Az akridin-narancs fluoreszcens festés alkalmazása a mikronukleusz tesztben. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. és Vannier, B. (1994). In vivo rágcsálók eritrocitáinak mikronukleusz-tesztje. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. és Newell, G.W. (1983). A mikronukleuszok indukciója mint a genotoxicitás mérőszáma. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Micronuclei indukciója patkányok csontvelőjében és perifériás vérében akut és szubkrónikus azathioprin kezelést követően. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. és Sutou, S. (1995). Optimális, általánosított 30 ±6 órás mintavételi idő a kettős adagolást követően az egér perifériás vér mikronukleusz tesztben. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadién: Mikronukleált eritrociták indukciója B6C3F1 egerek perifériás vérében, 13 hétig tartó belégzéssel exponálva. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). A mikronukleusz-értékelés validálása patkányban áramlási citometriával öt modellvegyülettel. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). A genotoxicitás értékelésének a rutin toxikológiai vizsgálatokba való integrálásának elvei és gyakorlata: A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. és Savage, J.R.K. (1989). In Vivo citogenetikai vizsgálatok statisztikai elemzése In: D.J. Kirkland (szerk.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney pp. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). Az expozíciós rend és időtartam hatása a benzol által kiváltott csont-maradvány károsodásra egerekben. I. Nemi összehasonlítás DBA/2 egerekben. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. és Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N. és Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: “Developments in Science and Practice of Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: A továbbfejlesztett mikronukleusz teszt alapja. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. és Shelby, M.E. (1990). Az in vivo eritrocita mikronukleusz teszt: A stabil állapotban történő mérés növeli a vizsgálat hatékonyságát és lehetővé teszi a toxicitási vizsgálatokkal való integrációt. Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNS in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Trenimon-indukált kromoszóma-károsodás hat emlősfaj csontvelősejtjeiben. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. és Heddle, J.A. (1990). Az in vivo mikronukleusz-teszt emlősök csontvelőjében és perifériás vérében. A U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program jelentése. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. és Adler I.-D. (1990). Antikinetochore antitest festés (CREST festés) alkalmazása in vivo indukált eritrocitákban lévő mikronukleuszok vizsgálatára. Mutagenesis 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Citogenetikai elemzés kvantitatív, nagy érzékenységű fluoreszcens hibridizációval. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. és Henderson, L. (1990). In vivo citogenetikai vizsgálatok, In: D.J. Kirkland (szerk.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. I. rész, felülvizsgált. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
36. Romagna, F. and Staniforth , C.D.(1989). Az automatizált csontvelő mikronukleusz teszt. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). A Cumulative Chromosomal Damage gyors szűrése egerekben. A keringő mikronukleált eritrociták felhalmozódása. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). The Persistence of Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes: Krónikus kromoszómabontás kimutatása egerekben. Mutatation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. és MacGregor, J.T. (1984). The Persistence of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Circulation of Normal and Splenectomized Fischer 344 Rats: Implications for Cytogenetic Screening. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. és Everson, R.B. (1986). A citogenetikai károsodás értékelése humán perifériás vér eritrocitáiban található mikronukleuszok mennyiségi meghatározásával. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). A mikronukleusz teszt. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. and Adler I.-D. (1997). Mikronukleuszok differenciálódása egér csontvelősejtekben: A CREST-festés és a centromerikus és telomerikus DNS-szondákkal végzett fluoreszcens in situ hibridizáció összehasonlítása. Mutagenesis 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U. és Adler I.-D. (1994). A kolhicinnel vagy akrilamiddal kiváltott extrudált mikronukleuszok többnyire elmaradó kromoszómákat tartalmaznak, amelyeket a festékkefe kenetekben a minor és major egér DNS szondákkal azonosítottak. Mutagenesis 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). A mikronukleált eritrociták és a DNS-károsodás mérése fenolftalein krónikus lenyelése során a p53 génre heterozigóta transzgenikus nőstény egerekben. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. és Matter, B.E. (1979). Mutagének in vivo citogenetikai szűrési módszerei, különös tekintettel a mikronukleusz tesztre. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L. és Kirsch-Volders M. (1989). Az egér csontvelő mikronukleusz teszt használható az aneogének és a klastogének megkülönböztetésére. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Fenolftalein: Mikronukleált eritrociták indukciója egerekben. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. és Kikuchi Y. (1980). A Clastogénekkel és orsóméreggel kiváltott mikronukleuszok átmérőjének összehasonlítása. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. and Kikuchi Y. (1981). Vizsgálatok a mikronuclei időreakcióról és a mutagének többszöri kezelésének hatásáról a mikronuclei indukciójára. Mutation Res. 90:163-173.