Proteinin ekspressio, puhdistus ja määritysmenetelmät hAASS-SDH
Vektori: pFB-LIC-Bse
Solulinja: DH10Bac
Tagit ja lisäykset: N-terminaalinen, TEV-proteaasilla pilkottavissa oleva heksahistidiinimerkki
Rakennetaan proteiinisekvenssi:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(alleviivattu sekvenssi sisältää vektorikoodattua His-tagia ja TEV-proteaasin pilkkomiskohtaa*)
Korjatut solut resuspendoitiin lyysipuskuriin (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 % glyseroli, 20 mM imidatsoli pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µl per 1 mL proteaasi-inhibiittorikoktail EDTA-vapaa).
Solupelletti liuotettiin noin 200 ml:aan lyysipuskuria ja rikottiin homogenisoimalla kahdella läpiviennillä 12 000 psi:n paineella. Solujätteet pelletöitiin 35000 x g:llä 1 tunnin ajan ja supernatanttia käytettiin puhdistukseen gravitaatiovirtauksen Ni-NTA-kolonnilla (5 ml).
Käytetyt puskurit on eritelty seuraavassa;
Sidontapuskuri: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glyseroli, 20 mM imidatsoli pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Pesupuskuri: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glyseroli, 40 mM imidatsoli pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Eluutiopuskuri: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glyseroli, 250 mM imidatsoli pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Kirkastettu soluuute lisättiin 5 ml:aan lyysipuskurilla esi-evakiloitua Ni-NTA- hartsia ja johdettiin lasikolonnin läpi. Tämän jälkeen pylväs pestiin sitoutumispuskurilla (2 x 50 ml) ja pesupuskurilla (2 x 50 ml). Proteiini eluoitiin eluointipuskurilla 5 x 5 ml:n fraktioissa. Pylväästä 1 eluoituneet fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin 5 ml:ksi 30 kDa MWCO:n spin-konsentraattorilla ja injektoitiin S200 16/60 -pylvääseen (esivakioitu GF-puskurissa (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % glyserolia)) nopeudella 1,0 ml/min. Kerättiin 1,5 ml:n fraktiot. Eluoitunut proteiini pilkottiin yön yli 4 °C:ssa TEV-proteaasilla (1/20 (w/w)). Seuraavana päivänä proteiininäyte ladattiin 0,5 ml:n Ni-sefaroosipylvääseen, joka oli esivakioitu GF-puskurilla pilkkomattoman proteiinin poistamiseksi. Yhdistetyt proteiinifraktiot konsentroitiin 13 mg/ml:ksi 30 kDa:n mwco-konsentraattorilla.
Aktiivisuusmääritys ja seulonta
HAASS:n SDH-aktiivisuus mitattiin seuraamalla NAD+:n pelkistymistä NADH:ksi käyttäen hyväksi sitä, että NADH:n pelkistynyt muoto fluoresoi, kun sitä herätetään 340 nm:n pituisella valolla. Hyväksyimme määrityksen 384-kuoppamuotoon, ja havaitsimme sen PheraStar-fluoresenssilukijalla (BMG Labtech) (heräte/emissio = 340/480 nm). Tämä määritys antoi lineaarisen vasteen proteiinipitoisuuden ollessa 150 nM. Tyypillinen reaktio koostuu 100 nM puhdistetusta entsyymistä, 0,2 mM NAD+:sta ja 1,3 mM sakkaropiinista. Reaktiopuskuri koostuu 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA, 0,05 % CHAPS. Yhdistekirjastot (LOPAC (Sigma) ja NIH Clinical Collections I&II) seulottiin talon sisällä 20 μM:n yhdistekonsentraatiolla.
Differentiaalinen skannausfluorimetria
DSF suoritettiin 96-kuoppalevyssä käyttäen Mx3005p RT-PCR-laitetta (Stratagene), jossa on 492 nm:n eksitaatio- ja 610 nm:n emissiosuodattimet. Kukin kuoppa sisälsi 2 µL proteiinia 2 µM DSF-puskurissa (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGEa, joka oli laimennettu 1000-kertaisesti DSF-puskurissa valmistajan varastosta (Invitrogen), ja (soveltuvin osin) 2 µL ligandia eri pitoisuuksina. Fluoresenssin intensiteetit mitattiin 25 °C:sta 96 °C:seen ramppinopeudella 3 °C/min.
Kiteytys
Apo-kiteet valmistettiin sekoittamalla 50 nl hAASS-SDH-proteiinia (80 mg/ml) 100 nl:aan säiliöliuosta, joka sisälsi 20 %:a PEG3350:tä, 0,1 M Tris pH 7,5:tä ja 0,2-0,33 M natriummalonaattia. NAD+:aan sitoutuneet kiteet valmistettiin sekoittamalla 100 nL hAASS-SDH-proteiinia (18 mg/ml, NAD+:n molaarisessa ylijäämässä) 50 nL:aan säiliöliuosta, joka sisälsi 25 % PEG3350:tä, 0,2 M NaCl:a ja 0,1 M tris pH 8,5. Kiteet kryosuojattiin 9-prosenttisessa butaanidiolissa ennen pakastamista nestemäisessä typessä. Fragmenttien seulontakampanjaa varten kiteet liotettiin yhdisteillä (10/50/500 mM) kiteytysliuoksessa, jota täydennettiin 8-prosenttisella butaanidiolilla, 5-30 minuutin ajan ja jäädytettiin nestemäisessä typessä.
Rakenteen määritysmenetelmät
hAASS-SDH:n apo- ja NAD+-sidoksissa olevat kiteet kuuluvat eri tilaryhmiin (P43212 vs P212121). hAASS-SDH:n rakenne ratkaistiin molekyylikorvaamalla PHASER-ohjelmalla käyttäen hakumallina S.cerevisiae-sienestä peräisin olevaa sakkaropiinireduktaasia (PDB-koodi 2AXQ) (38 % sekvenssi-identiteetti). Epäsymmetrisestä yksiköstä (a.u.) löytyi kaksi molekyyliä. Alkuperäinen malli rakennettiin uudelleen käyttämällä phenix.autobuild. Sitoutunut NAD+-molekyyli aktiivisessa keskuksessa tunnistettiin erotus-Fourier-menetelmällä ja sijoitettiin manuaalisesti elektronitiheyteen käyttäen Cootia. Mallin viimeistelemiseksi suoritettiin iteratiivisia phenix.refine-syklejä, mukaan lukien TLS-jalostus, jota seurasi manuaalinen mallin rakentaminen puuttuvien jäännösten osalta Cootin avulla. NCS-rajoitteita ei sovellettu konformaatioerojen vuoksi domeenin III (res 278-376) kahdessa kopiossa a.u. Liuotinaineatomit sijoitettiin neljän viimeisen tarkennuskierroksen aikana phenix.refine-ohjelmalla. Fragmenttien seulontakampanjaa varten ligandit tunnistettiin DIMPLE-ohjelmalla (8)(https://github.com/ccp4/dimple) käyttäen erotustiheyskarttoja. Heikommat sidosaineet, joilla oli alhainen miehitys, arvioitiin käyttämällä PANDDAa (9)(https://pandda.bitbucket.io/), joka perustuu tilastollisiin malleihin, joilla löydetään tietyssä tietokokonaisuudessa esiintyvä liganditiheys, jota ei esiinny useimmissa tietokokonaisuuksissa. Kaikkien tietokokonaisuuksien koordinaatit ja rakennekertoimet on talletettu RCSB Protein Data Bankiin. Tiedonkeruu- ja tarkennustilastot ovat saatavilla PDB:n sivuilta.
Kaupallisesti saatavilla olevat reagenssit
CRISPR/Cas9 knockout-plasmidit
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157
.