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Tipi di 2D NMR
La spettroscopia NMR bidimensionale (2D) include:-
Homonucleare
- Tramite legame: COSY, TOCSY, 2D-INADEQUATE, 2D-ADEQUATE
- Traverso lo spazio: NOESY, ROESY
Correlazione eteronucleare
- Correlazione a un legame HSQC, HMQC
- Correlazione a lungo raggio HMBC
Esempi di assegnazione spettrale 2D
Assegnazione del 12,14-ditbutilbenzochrysene
Assegnazione del colesteril acetato
La base del 2D NMR
In un esperimento 1D-NMR la fase di acquisizione dei dati avviene subito dopo la sequenza di impulsi. Questo ordine viene mantenuto anche con esperimenti complessi, sebbene una fase di preparazione venga aggiunta prima dell’acquisizione. Tuttavia, in un esperimento 2D-NMR, la fase di acquisizione è separata dalla fase di eccitazione da fasi intermedie chiamate evoluzione e miscelazione. Il processo di evoluzione continua per un periodo di tempo etichettato t1. L’acquisizione dei dati comprende un gran numero di spettri che vengono acquisiti come segue: la prima volta il valore di t1 è impostato vicino a zero e viene acquisito il primo spettro. La seconda volta, t1 viene aumentato di Δt e viene acquisito un altro spettro. Questo processo (di incremento di t1 e di acquisizione di spettri) viene ripetuto fino a quando ci sono abbastanza dati per l’analisi utilizzando una trasformata di Fourier 2D. Lo spettro è di solito rappresentato come una mappa topografica dove uno degli assi è f1 che è lo spettro nella dimensione t1 e il secondo asse è quello che viene acquisito dopo le fasi di evoluzione e miscelazione (simile all’acquisizione 1D). L’intensità del segnale è indicata da un colore più forte quanto più è intenso.
Nella mappa topografica risultante i segnali sono una funzione di due frequenze, f1 e f2. È possibile che un segnale appaia a una frequenza (ad esempio, 20 Hz) in f1 e un’altra frequenza (ad esempio, 80 Hz) f2 che significa che la frequenza del segnale è cambiata durante il tempo di evoluzione. In un esperimento 2D-NMR si misura il trasferimento di magnetizzazione. A volte questo avviene attraverso legami con lo stesso tipo di nucleo come in COSY, TOCSY e INADEQUATE o con un altro tipo di nucleo come in HSQC e HMBC o attraverso lo spazio come in NOESY e ROESY.
Le varie tecniche 2D-NMR sono utili quando 1D-NMR è insufficiente come quando i segnali si sovrappongono perché le loro frequenze di risonanza sono molto simili. Le tecniche 2D-NMR possono far risparmiare tempo soprattutto quando si è interessati alla connettività tra diversi tipi di nuclei (ad esempio, protone e carbonio).
L’esperimento base 2D NMR (fig. 1) consiste in una sequenza di impulsi che eccita i nuclei con due impulsi o gruppi di impulsi ricevendo poi il decadimento libero di induzione (fid). I gruppi di impulsi possono essere puramente a radiofrequenza (rf) o possono includere impulsi a gradiente magnetico. L’acquisizione viene effettuata molte volte, incrementando il ritardo (tempo di evoluzione – t1) tra i due gruppi di impulsi. Il tempo di evoluzione è etichettato t1 e il tempo di acquisizione, t2.
Fig. 1. Sequenza d’impulsi di base per l’acquisizione 2D
Trasformazione di Fourier 2D
La FID viene poi trasformata in Fourier in entrambe le direzioni (fig. 2) per ottenere lo spettro. Lo spettro è convenzionalmente visualizzato come un diagramma di contorno. La frequenza di evoluzione è etichettata f1 e la frequenza di acquisizione è etichettata f2 e tracciata da destra a sinistra.
Fig. 2. Trasformazione di Fourier 2D
Lo spettro 2D è solitamente tracciato con le sue proiezioni 1D per chiarezza. Queste possono essere proiezioni autentiche o gli equivalenti spettri 1D. In uno spettro omonucleare c’è di solito una diagonale (con l’eccezione del 2D-INADEQUATE) che rappresenta la correlazione dei picchi con se stessi e non è di per sé molto informativa. I segnali lontani dalla diagonale rappresentano le correlazioni tra due segnali e sono utilizzati per l’assegnazione. Per esempio nello spettro COSY omonucleare in Fig. 3, il segnale 1H a 1.4 ppm è correlato con il segnale 1H a 2.8 ppm perché ci sono picchi incrociati ma non sono correlati con i segnali a 7.3 ppm.
Fig. 3. Spettro COSY 2D di etilbenzene
In uno spettro eteronucleare non ci sono segnali diagonali e tutti i segnali rappresentano correlazioni. Per esempio nello spettro di correlazione a corto raggio HSQC eteronucleare in fig. 4, il segnale 1H a 1,4 ppm è correlato al segnale 13C a 15,7 ppm, il segnale 1H a 2.8 ppm è correlato al segnale 13C a 29,0 ppm, ecc.
Fig. 4. Spettro 2D HSQC di etilbenzene
I segnali in uno spettro 2D non sono sempre in fase pura. A volte, la fase non può essere espressa semplicemente come in HMBC e 2D-INADEQUATE, nel qual caso viene tracciato uno spettro di magnitudine. Tuttavia, gli spettri di grandezza sacrificano la risoluzione rispetto agli spettri di fase pura (e a differenza delle funzioni finestra che allargano le linee, non producono guadagni di sensibilità). Pertanto, ove possibile, lo spettro 2D dovrebbe essere in fase. I segnali risultanti possono essere a fase pura, antifase o a fase negativa come in fig. 5. I segnali negativi sono convenzionalmente rappresentati da contorni punteggiati o rossi.
Fig. 5. Possibili fasi per una correlazione tra due doppietti
