5-idrossimetilcitosina e i suoi ruoli potenziali nello sviluppo e nel cancro

Duale ruolo della 5-idrossimetilcitosina come base stabile del DNA e come intermedio nella demetilazione del DNA

Ora sappiamo che i livelli di 5hmC variano sostanzialmente tra diversi tipi di cellule e tessuti e sono più alti nel cervello, in particolare nei neuroni . Poiché 5hmC è un prodotto di ossidazione di 5mC, è chiaro che la formazione di 5hmC da 5mC abbassa automaticamente i livelli di 5mC in qualsiasi posizione di nucleotide o addirittura in tutto il genoma. Pertanto, è stato immediatamente evidente che la conversione di 5mC in 5hmC potrebbe essere il primo passo in un percorso che porta alla demetilazione del DNA. Ci sono prove da vari sistemi sperimentali che questo può effettivamente essere il caso. Il risultato finale di questo percorso di demetilazione è la rimozione passiva o attiva della base modificata e/o la scomparsa del gruppo metile dalla citosina nel DNA (Figura 1). Nel percorso di demetilazione passiva, 5hmC non può essere copiato dalla metiltrasferasi del DNA di mantenimento, DNMT1, un enzima che propaga i modelli di metilazione preesistenti e opera sui siti CpG emimetilati. Il processo di demetilazione attiva che utilizza 5hmC come intermedio è notevolmente più complicato. Un rapporto ha suggerito che 5hmC può essere convertito in citosina dalle metiltransferasi del DNA. La deaminazione di 5hmC produce 5-idrossimetiluracile, che può essere rimosso dagli enzimi di riparazione dell’escissione della base, tra cui la timina glicosilasi del DNA (TDG) e l’uracile monofunzionale selettivo del DNA glicosilasi (SMUG1). Tuttavia, quanto efficacemente tale percorso sia operativo in vivo è attualmente sconosciuto. L’ossidazione graduale di 5hmC da parte delle proteine TET produce 5-formilcitosina (5fC) e poi 5-carbossilcitosina (5caC) . Questa 5caC, che è rilevabile a bassi livelli nel DNA, può quindi essere rimossa o tramite riparazione per escissione di base catalizzata dall’attività di DNA glicosilasi della proteina TDG, o tramite decarbossilazione. Teoricamente, il percorso di decarbossilazione dovrebbe essere favorevole in quanto non richiede la rottura dei legami fosfodiesteri del DNA, che si verifica durante la riparazione per escissione di base avviata da TDG. Tuttavia, ad oggi, nessuna attività enzimatica per la fase di decarbossilazione è stata identificata anche se la decarbossilazione sembra verificarsi.

Molti tessuti accumulano livelli piuttosto sostanziali di 5hmC, molto maggiori di quanto ci si aspetterebbe se questa base fosse semplicemente un intermedio transitorio in un percorso di ossidazione sequenziale che porta alla demetilazione del DNA. Pertanto, 5hmC può essere un modulo epigenetico che ha le sue proprietà uniche di codifica biochimica. Questa funzione può essere negativa o repulsiva poiché l’ossidazione del gruppo metile durante la produzione di 5hmC blocca il legame delle proteine che altrimenti interagirebbero con 5mC. In alternativa, la sua funzione può essere positiva o istruttiva se esistono proteine che si legano specificamente a 5hmC. Finora, diverse proteine diverse hanno mostrato la capacità di riconoscere 5hmC, almeno in vitro, tra cui UHRF1 , MBD3 , MeCP2 , e diversi altri identificati da un approccio proteomico . Tuttavia, il ruolo biologico del loro legame a 5hmC non è ancora del tutto chiaro. La maggior parte di queste proteine hanno anche altre funzioni, e quindi potrebbero non essere progettate esclusivamente per interagire con 5hmC.

Il ruolo della 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e nella differenziazione dei mammiferi

Il ruolo funzionale di 5hmC nei genomi dei mammiferi non è ancora chiaro. All’inizio del ciclo vitale dei mammiferi, al momento della fecondazione degli ovociti da parte dello sperma, la maggior parte del 5mC nel genoma paterno (derivato dallo sperma) si ossida per formare 5hmC . Questa fase di ossidazione, che in precedenza si pensava riflettesse una vera e propria “demetilazione” del DNA, è specifica del genoma paterno, mentre il genoma materno (derivato dagli ovociti) rimane protetto dall’ossidazione catalizzata da Tet. L’ossidazione del genoma paterno è catalizzata da Tet3, codificato dall’unico gene Tet espresso a livelli sostanziali negli ovociti e negli zigoti. Il knockout genetico di Tet3 nei topi si traduce in una mancata ossidazione del genoma paterno, uno sviluppo compromesso e una letalità perinatale.

Un’altra importante transizione di sviluppo coinvolge la demetilazione globale del DNA nelle cellule germinali primordiali (PGC) che inizia intorno al giorno embrionale 8,5-9,5 e si completa vicino al giorno embrionale 13,5. I meccanismi di cancellazione della metilazione nelle PGC sono rimasti in gran parte poco chiari e controversi. È stato a lungo ipotizzato che la demetilazione attiva del DNA indipendente dalla replicazione sia un percorso chiave probabilmente coinvolto in questo passaggio. Tuttavia, dati più recenti favoriscono una perdita passiva di metilazione causata dalla mancanza di mantenimento della metilazione durante la replicazione del DNA. Questa perdita passiva di 5mC può essere effettivamente avviata dalla conversione di 5mC in 5hmC. Tet1 e Tet2 sono le 5mC ossidasi maggiormente espresse nelle PGC in questa fase. La progenie di topi carenti di Tet1 e Tet2 ha carenze nella demetilazione del DNA nei geni impressi. Tuttavia, gli animali carenti di Tet1/2 di entrambi i sessi erano fertili, con le femmine che avevano ovaie più piccole e ridotta fertilità. La delezione di Tet1 e Tet2 può produrre adulti vitali, anche se la maggior parte di tali topi muoiono durante l’embriogenesi o intorno alla nascita e mostrano vari difetti di sviluppo. I dati suggeriscono che l’ossidazione 5mC indotta da Tet1/2 nelle PGC non è assolutamente necessaria per la produzione di prole vitale. Le informazioni attualmente disponibili sulla demetilazione del DNA negli zigoti e nelle PGC mancano ancora di un’analisi più specifica di 5hmC a livello di sequenza del DNA, come può essere realizzato, per esempio, da TAB-sequencing. Ci si aspetta che tali informazioni chiariscano il coinvolgimento globale o locus-specific della formazione di 5hmC nell’inizio della demetilazione passiva (o attiva) del DNA. La precedente implicazione dei processi di riparazione dell’escissione della base nella riprogrammazione della linea germinale, che di per sé porrebbe un enorme rischio per il mantenimento dell’integrità del genoma se operante a livello globale, può avere varie altre spiegazioni. In uno scenario, il verificarsi dell’attività di riparazione dell’escissione della base potrebbe essere spiegato dalla necessità di contrastare le reazioni di ossidazione spurie non mirate catalizzate dall’attività della Tet ossidasi sulle guanine nei siti CpG metilati (essendo la guanina la base del DNA più suscettibile all’ossidazione). In un’altra impostazione, 5hmC può essere ossidato ulteriormente, forse in sequenze specifiche, dalle proteine Tet per formare 5caC, che viene poi rimosso dalla riparazione per escissione di base avviata da TDG.

Poiché 5hmC è più abbondante nel tessuto cerebrale, è diventata una priorità capire la funzione di questa base modificata nel cervello. Per esempio, nel DNA della corteccia cerebrale umana, il livello di 5hmC è circa l’1% di tutte le citosine o dal 20 al 25% di tutte le basi 5mC. Questo corrisponde a circa 6.000.000 di basi 5hmC per genoma aploide. Chiaramente questi livelli suggeriscono che la 5hmC ha un importante ruolo funzionale nel cervello dei mammiferi. Gli studi riportati finora hanno dimostrato che il 5hmC nei tessuti cerebrali è molto abbondante all’interno delle regioni geniche, sia nei promotori che, ancor più, nelle regioni intrageniche, i cosiddetti corpi genici. È ipotizzabile che la formazione di 5hmC a promotori, isole CpG o coste di isole CpG (bordi) funzioni analoghe a un processo di riparazione per ossidare ed eventualmente rimuovere 5mC inappropriatamente introdotti in queste regioni. La deposizione di 5hmC nei promotori o nei corpi genici è spesso correlata positivamente all’attività genica. Il meccanismo di come il 5hmC associato al corpo del gene aumenta i livelli di trascrizione è attualmente sconosciuto. Una possibilità è che l’ossidazione del 5mC rilasci un effetto repressivo sulla trascrizione, forse contrastando la trascrizione intragenica spuria antisenso. Altre spiegazioni possono includere il fatto che 5hmC ha un effetto destabilizzante sulla struttura del DNA che potenzialmente favorisce l’apertura della doppia elica da parte dell’apparato di trascrizione.

5hmC, anche se non riconosciuto da diverse proteine leganti methyl-CpG, tra cui MBD1, MBD2 e MBD4, è in grado di legare MeCP2, una proteina legante methyl-CpG che è abbondante nel cervello ed è mutata nella sindrome neurologica Rett. Studi precedenti, utilizzando il dominio di legame metil-CpG (MBD) di MeCP2 piuttosto che la proteina completa, non hanno concluso che MeCP2 si lega a 5hmC. Le ragioni di queste discrepanze non sono chiare. La connessione tra MeCP2 e 5hmC nel cervello è di particolare interesse poiché i livelli di 5hmC sono più alti nel cervello e MeCP2 è una proteina abbondante nel cervello che raggiunge livelli simili a quelli dell’istone H1. Per queste ragioni, un ruolo meccanicistico genoma-wide piuttosto che sequenza-specifico di 5hmC-binding da MeCP2 può essere anticipato nel cervello.

Come dimostrato recentemente, la formazione di 5hmC è critica per lo sviluppo del cervello. La base è abbondante nei neuroni in via di sviluppo in cui il suo livello aumenta rispetto alle cellule progenitrici neurali e dove si localizza specificamente ai corpi genici di geni importanti per la differenziazione neuronale. Tet3 è più altamente espresso nella corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo seguita da Tet2 e i livelli di Tet1 sono molto bassi in questo tessuto. Un aumento dei livelli di Tet2, Tet3 e 5hmC nei neuroni in fase di differenziazione coincide con la riduzione della metiltransferasi Polycomb H3K27 Ezh2 e la perdita di H3K27me3 nei geni critici. Riducendo i livelli di Tet2 e Tet3 o aumentando l’espressione di Ezh2 si ottiene un differenziamento neuronale incompleto o bloccato. Così, la formazione di 5hmC promuove la differenziazione neuronale modulando l’espressione dei geni più critici in questa importante transizione di sviluppo.

La perdita di 5-idrossimetilcitosina nel cancro

I livelli di 5hmC nel cancro sono fortemente ridotti rispetto al corrispondente tessuto normale che circonda il tumore. Utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa, l’immuno-dot blot con anticorpi anti-5hmC e l’immunoistochimica, abbiamo dimostrato la perdita di 5hmC associata al tumore per i tumori del polmone, del cervello, del seno, del fegato, del rene, della prostata, dell’intestino, dell’utero e del melanoma. Altri ricercatori hanno confermato questa osservazione mostrando la perdita di 5hmC in diversi tipi di tumori solidi. Inoltre, la reintroduzione di TET2 ha dimostrato di ripristinare i livelli di 5hmC e diminuire il potenziale metastatico delle cellule di melanoma. Sorprendentemente, quando abbiamo co-immunizzato sezioni di tessuto con anticorpi contro 5hmC e contro l’antigene Ki67, che è un marcatore trovato solo nelle cellule proliferanti, abbiamo osservato che 5hmC e Ki67 non sono quasi mai presenti contemporaneamente in una singola cellula. A livello diagnostico clinico, l’analisi immunoistochimica combinata della perdita di 5hmC e della presenza di cellule Ki67-positive potrebbe essere sviluppata in un biomarcatore per la diagnosi del cancro. La mancanza o la forte riduzione di 5hmC nei tumori suggerisce che le cellule proliferanti perdono 5hmC. Nella maggior parte dei casi, la massa tumorale è impoverita di 5hmC anche quando le cellule Ki67-positive sono rare, suggerendo che queste cellule tumorali hanno avuto una storia passata di proliferazione che ha portato alla perdita di 5hmC, che poi non viene ristabilita. La perdita dipendente dalla replicazione di 5hmC riflette una situazione che ricorda quella degli embrioni preimpianto in cui la formazione iniziale di 5hmC nel DNA paterno è seguita dalla perdita dipendente dalla replicazione o dalla diluizione di questo marchio. Allo stesso modo, il contenuto globale di 5hmC diminuisce rapidamente quando le cellule del tessuto normale si adattano alla coltura cellulare. La spiegazione più semplice è che l’ossidazione di 5mC produce un sito CpG emi-idrossimetilato nel DNA che non viene riconosciuto da DNMT1 durante la replicazione del DNA. Tale spiegazione è coerente con gli studi in vitro che mostrano che DNMT1 non è in grado di operare sui siti CpG che contengono 5hmC. Tuttavia, sono possibili anche altre spiegazioni per la riduzione di 5hmC nel cancro. I livelli delle proteine TET possono essere inferiori nel tessuto tumorale rispetto alla sua controparte normale corrispondente. Anche se non abbiamo osservato differenze coerenti a livello di RNA per TET1, TET2, o TET3 nei tumori del polmone e del cervello rispetto al tessuto normale, altri hanno riportato livelli inferiori di espressione genica TET nel cancro. Un’ulteriore possibilità è che le cellule tumorali contengono vie metaboliche compromesse che sono coinvolte nella produzione del co-fattore per l’attività TET, il 2-oxoglutarato (vedi sotto).

Mutazione di TET2 nel cancro umano

TET1 appartiene a una famiglia di proteine caratterizzate come promotrici della conversione di 5mC a 5hmC nel DNA dei mammiferi. Ci sono tre membri identificati appartenenti alla famiglia TET: TET1, TET2 e TET3. TET1 si trova sul cromosoma umano 10q21.3, mentre TET2 si trova sul cromosoma 4q24 e TET3 sul cromosoma 2p13.1. L’enzima TET1 consiste in un dominio di legame al DNA zinc finger CXXC, una regione ricca di cisteina e un dominio diossigenasi dipendente dal 2-oxoglutarato e dal ferro (II) (2OGFeDO). TET3 contiene anche un dominio CXXC N-terminale. Tuttavia, il gene TET2 ha subito un’inversione cromosomica durante l’evoluzione, separando così il suo dominio CXXC dal dominio catalitico e creando un nuovo gene con dominio CXXC chiamato IDAX/CXXC4, che codifica un regolatore negativo di TET2. Sulla base dei profili EST e degli array di espressione, TET1 mostra la massima espressione durante l’embriogenesi e non mostra un’espressione rilevante nei tessuti adulti. TET2 è principalmente espresso nelle cellule ematopoietiche e TET3 sembra ubiquitariamente espresso nei tessuti umani adulti.

La leucemia è una malattia in cui, durante la normale differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche, l’espansione clonale delle cellule precursori ematopoietiche nel midollo osseo è compromessa in una certa fase della differenziazione, causando uno squilibrio tra differenziazione e autorinnovamento. L’espansione inappropriata delle cellule progenitrici ematopoietiche è causata principalmente da un blocco della maturazione cellulare. I disturbi della sindrome mielodisplastica (MDS) nell’emopoiesi sono caratterizzati da citopenia (basso numero di cellule del sangue), emopoiesi inefficace in una linea cellulare o in un’altra, e un aumentato rischio di trasformazione in leucemia mieloide acuta (AML) . Nella AML, la rapida crescita di globuli bianchi anormali nel midollo osseo porta ad un blocco nella produzione di varie cellule di altre linee cellulari.

TET2 è stato trovato mutato in pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN), SMD, AML e leucemia mielomonocitica cronica (CMML), ed è il gene più comunemente mutato in SMD. Le mutazioni di TET1 o TET3 non sono osservate nelle SMD, né la mutazione TET2 è correlata a diverse altre mutazioni comuni note. È interessante notare che le mutazioni dell’isocitrato deidrogenasi 1/2 (IDH1/2) si trovano raramente insieme alle mutazioni TET2, ma hanno effetti simili alle mutazioni TET2 sulle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Mentre le mutazioni TET2 sono associate a una ridotta sopravvivenza complessiva nella LAM rispetto ai pazienti con TET2 wild-type, le mutazioni TET2 nei pazienti MDS e MPN promuovono la progressione alla LAM. Il gene TET2 è composto da un totale di undici esoni, che si traduce in un prodotto proteico di 2002 aminoacidi. Le mutazioni di TET2 nei tumori mieloidi sono state osservate più comunemente negli esoni 3a e 10, che sono gli esoni più lunghi. Sia le cellule progenitrici multipotenti che quelle impegnate nel lignaggio ematopoietico sono bersaglio delle mutazioni di TET2 in MPN, il che implica che TET2 svolge un ruolo importante nella mielopoiesi. Delezioni di TET2 e perdita di eterozigosi o disomia uni-parentale è stata osservata in (9%) pazienti MDS/AML con TET2 mutato, dove è probabile che l’allele wild-type venga perso durante la ricombinazione, permettendo a TET2 mutato di promuovere un fenotipo di perdita di funzione. Kosmider et al. hanno osservato che il 50% dei pazienti con TET2 mutato aveva difetti genetici che miravano alle due copie di TET2. Le mutazioni in TET2 sembrano portare alla perdita di funzione, suggerendo che può svolgere un ruolo soppressivo del tumore.

Comprendere le implicazioni sottostanti alla mancanza di funzione di TET2 mutante e il suo ruolo nei tumori maligni mieloidi è una priorità della ricerca attuale. Diversi laboratori hanno generato modelli di topi knockout Tet2 condizionali in cui gli esoni critici di Tet2 sono stati presi di mira. Moran-Crusio et al. hanno osservato che i topi Tet 2-/- hanno sviluppato splenomegalia a 20 settimane di età, mostrando fenotipi simili a quelli osservati nei pazienti umani CMML con TET2 mutante. I dati dei diversi modelli murini hanno portato a osservazioni simili. Cancellazione Tet2 non è embrionale letale. Un’importante osservazione fatta da Moran-Crusio et al. e da Ko et al. è che le cellule staminali ematopoietiche da topi Tet2-/- hanno una maggiore capacità di ripopolare il compartimento ematopoietico in vivo durante i saggi di ricostituzione competitiva con la concorrenza delle HSCs da cellule Tet2+/+. L’analisi di vari organi di topi Tet2-/- ha mostrato che la perdita di Tet2 non è compensata da un aumento dell’espressione di Tet1 o Tet3. I livelli di 5hmC sono significativamente diminuiti nel midollo osseo e nella milza dei topi Tet2-/-. I topi Tet2-/- mostrano un aumento delle CSE con un leggero aumento dei progenitori mieloidi, orientando l’emopoiesi verso i destini cellulari monocitari/macrofagi. Si suggerisce che un Tet2 attivo regolerebbe l’ematopoiesi normale per assicurare la corretta distribuzione del lignaggio e la differenziazione controllata delle CSE. Di particolare interesse è l’effetto delle mutazioni di TET2 sui livelli e sui modelli di 5mC nel genoma. Tuttavia, i dati attuali sono tutt’altro che chiari. Mentre un rapporto ha indicato che la mutazione TET2 in AML è associata a un fenotipo di ipermetilazione del DNA, altri dati hanno suggerito che i campioni di midollo osseo di pazienti con mutazioni TET2 hanno bassi livelli di 5hmC e ipometilazione del DNA. La situazione è complicata dal fatto che i tumori maligni ematopoietici sono spesso caratterizzati da mutazioni in diversi modificatori epigenetici tra cui EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A e ASXL1, quindi potenzialmente oscurando qualsiasi associazione diretta. Per esempio, in uno studio, otto degli undici pazienti con mutazioni DNMT3A (73%) nel linfoma a cellule T avevano anche mutazioni TET2.

Mutazioni nelle vie dei cofattori

5mC ossidasi sono enzimi 2-oxoglutarato-dipendenti (Figura 2). Questo cofattore è prodotto nel ciclo dell’acido tricarbossilico dall’isocitrato dall’enzima IDH. È interessante notare che diversi tipi di tumori umani contengono mutazioni nel gene IDH1. Le mutazioni IDH1 sono particolarmente frequenti nei gliomi di grado II e III, dove si trovano fino al 70% dei pazienti. Le mutazioni in IDH1 e IDH2 sono anche viste nelle leucemie mieloidi e in alcuni altri tumori maligni, ma con una frequenza inferiore. Queste mutazioni IDH1 non sono sparse in tutto il gene, ma si trovano quasi esclusivamente nella posizione aminoacidica 132. Questa scoperta suggerisce che questa particolare proteina IDH1 mutante ha una proprietà di guadagno di funzione. Una scoperta sorprendente è stata che il mutante IDH1 dal codone 132 arginina a istidina produce l’oncometabolita 2-idrossiglutarato (2HG) come prodotto di reazione invece del 2-ossoglutarato. Sembra che la reazione di ossidazione dell’isocitrato effettuata da questo mutante sia incompleta e produca solo 2HG. Inoltre, il 2HG è un inibitore competitivo di molte, se non tutte, le attività enzimatiche dipendenti dal 2-oxoglutarato. Le proteine TET rappresentano una classe di tali enzimi, ed è stato dimostrato che il 2HG è un inibitore di TET1 e TET2.

Un’interessante correlazione dell’avere IDH1 mutato nei tumori del glioma è che i tumori IDH1-mutanti sono quasi sempre associati ad abbondanti cambiamenti a livello del genoma nella metilazione del DNA come indicato dalla diffusa ipermetilazione delle isole CpG. Questo fenotipo è stato indicato come fenotipo CpG-isola metilatrice (o CIMP). Si è tentati di presumere che il CIMP nei gliomi IDH1-mutanti sia legato ad una mancata produzione di 5hmC in questi tumori perché l’attività TET è compromessa da 2HG. Infatti, l’introduzione sperimentale di un costrutto IDH1 mutante negli astrociti umani ha portato alla comparsa di un fenotipo simile a CIMP. Inoltre, nei topi knock-in condizionali in cui il più comune mutante Idh1 R132H è stato inserito nel locus endogeno Idh1 ed è stato espresso nelle cellule ematopoietiche, è stata osservata una ipermetilazione del DNA. Tuttavia, in un confronto diretto dei livelli di 5hmC nel DNA tra i gliomi IDH1 mutanti e IDH1 wild-type, non abbiamo osservato alcuna differenza sostanziale tra queste due categorie di tumori cerebrali. Pertanto, è necessario tenere a mente che IDH1 mutante e il suo prodotto metabolico 2HG non solo influenzano gli enzimi TET ma inibiscono anche molte demetilasi della lisina che dipendono dal 2-oxoglutarato e altri enzimi dipendenti dal 2-oxoglutarato. La disfunzione di queste demetilasi della lisina può avere un impatto secondario sui modelli di metilazione del DNA alle isole CpG.