ABT-263: Un potente e biodisponibile per via orale inibitore della famiglia Bcl-2

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ABT-263 è un inibitore della famiglia Bcl-2 disponibile per via orale. Le caratteristiche strutturali di ABT-737 che conferiscono proprietà indesiderate al farmaco derivano da elementi di progettazione essenziali per l’inibizione di una grande superficie, l’interazione idrofobica proteina-proteina e la riduzione del legame con l’albumina del siero (4-6). Per migliorare l’efficacia orale di questa molecola relativamente grande (MW >800), è stato necessario un attento equilibrio tra affinità di destinazione, potenza cellulare e assorbimento orale. Sono stati identificati tre siti chiave lungo la spina dorsale di ABT-737 che influenzano l’equilibrio di carica, il metabolismo e l’assorbimento orale (Fig. 1). Gli analoghi che incorporano modifiche in queste posizioni sono stati ottimizzati per massimizzare il rapporto farmacocinetico/farmacodinamico tra esposizione orale negli animali ed efficacia nelle linee cellulari tumorali umane. Questi sforzi hanno portato all’identificazione di ABT-263.

ABT-263 mantiene alta affinità per Bcl-xL, Bcl-2 e Bcl-w, che è sotto il limite di rilevamento del saggio di polarizzazione della fluorescenza (Ki ≤ 1 nmol/L), ma si lega più debolmente a Mcl-1 e A1 (tabella 1). Questo modello di selettività è simile a quello del suo predecessore ABT-737 e della proteina BH3-only Bad (12). L’affinità subnanomolare di ABT-263 per Bcl-xL è stata confermata da un saggio di trasferimento di energia con risonanza di fluorescenza più sensibile nel tempo che mostra che l’enantiomero (uno stereoisomero con la configurazione opposta del gruppo morfolinoetilico, usato come controllo meno attivo) è ∼40 volte meno potente.

Il profilo farmacocinetico di ABT-263 è caratterizzato da bassi valori di clearance plasmatica e bassi volumi di distribuzione nel topo, ratto, cane e scimmia, con emivita di eliminazione plasmatica dopo la dose i.v. di 4,6 a 8,4 ore (Tabella supplementare S1). La biodisponibilità dopo gavage orale era ∼20% in tutte e quattro le specie. A causa della sua bassa solubilità acquosa, l’ABT-263 mostra un assorbimento orale limitato alla velocità di dissoluzione prolungata. La somministrazione per via parenterale in formulazioni a base di lipidi, in cui il composto è significativamente più solubile, produce un maggiore assorbimento con una biodisponibilità vicina al 50% e un’emivita di eliminazione orale di 8,9 ore nei cani. Una curva rappresentativa della concentrazione del farmaco nel plasma dopo la somministrazione i.v. o p.o. nel cane è mostrata nella Fig. S1.

ABT-263 esibisce una citotossicità basata sul meccanismo. Un certo numero di piccole molecole mimetiche BH3 sono state segnalate per legare i membri della famiglia Bcl-2 con affinità modesta e indurre l’apoptosi in linee cellulari tumorali (21-23). Tuttavia, molti di questi agenti hanno recentemente dimostrato di uccidere le cellule in un modo Bax/Bak-indipendente, mettendo in discussione la rilevanza funzionale della loro debole affinità per le proteine Bcl-2 e i veri meccanismi d’azione di queste molecole (14). Pertanto, abbiamo ritenuto importante dimostrare in modo robusto che l’apoptosi indotta da ABT-263 era il risultato diretto dell’inibizione delle proteine della famiglia Bcl-2. In primo luogo, l’attività cellulare di ABT-263 è stata valutata nella linea cellulare murina FL5.12 prolinfocitica interleuchina-3 (IL-3) dipendente. La sospensione di IL-3 induce l’apoptosi di FL5.12, in parte attraverso l’up-regolazione dei fattori proapoptotici Bim e Puma (24, 25). La sovraespressione di Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) o Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) protegge dagli effetti del ritiro di IL-3 attraverso il sequestro di Bim e Puma (25). ABT-263, ma non l’enantiomero, ha invertito la protezione offerta dalla sovraespressione di Bcl-2 o Bcl-xL (EC50 = 60 e 20 nmol/L, rispettivamente; Fig. 2A). ABT-263 era inefficace nel provocare la morte cellulare in presenza di IL-3 dove le cellule FL5.12 non erano soggette a stimoli proapoptotici. La capacità dell’ABT-263 di uccidere le cellule FL5.12-Bcl-2 o FL5.12-Bcl-xL sotto il ritiro di IL-3 è stata significativamente attenuata in presenza dell’inibitore della caspasi ZVAD, indicando che l’uccisione delle cellule è caspasi dipendente (Fig. supplementare S2).

Per determinare se la citotossicità indotta dall’ABT-263 può essere attribuita alla rottura delle interazioni proteina-proteina intracellulare della famiglia Bcl-2, sono stati fatti studi di coimmunoprecipitazione. ABT-263 ha indotto una diminuzione dose-dipendente in Bim:Bcl-xL interazioni entro 2 ore post-trattamento in FL5.12-Bcl-xL cellule (Supplementary Fig. S3). Modelli simili sono stati osservati anche per la rottura di Bim: Bcl-2 complessi in FL5.12-Bcl-2 cellule (dati non mostrati), indicando che ABT-263 ripristina IL-3-dipendente morte cellulare attenuando la capacità di Bcl-xL e Bcl-2 di sequestrare fattori proapoptotici come Bim. La capacità dell’ABT-263 di interrompere le interazioni proteina-proteina della famiglia Bcl-2 è stata confermata in un sistema two-hybrid nei mammiferi (Fig. 2B). ABT-263 ha inibito l’interazione di VP16-Bcl-xS con Gal4-Bcl-xL (apparente EC50 ∼50 nmol/L), mentre l’enantiomero era molto meno efficace.

Per interrogare ulteriormente il meccanismo d’azione, l’attività di ABT-263 è stata valutata in una serie di cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che includevano cellule wild-type (WT) e cellule carenti di Bcl-x, Mcl-1 e Bax/Bak (DKO). ABT-263 potentemente indotto la morte cellulare in Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L) ma non Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) cellule MEF (Fig. supplementare S4A). Questo conferma la capacità di ABT-263 di inibire funzionalmente Bcl-xL, ma non Mcl-1, in un contesto cellulare ed è coerente con precedenti osservazioni con ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). L’enantiomero era inefficace in entrambi i sistemi. ABT-263 è stato anche inefficace (EC50 ≥10 μmol/L) nell’uccidere le cellule WT o DKO MEF, in linea con i rapporti precedenti (14). Al contrario, etoposide, un agente citotossico generale, così come due segnalati mimetici BH3 piccole molecole, ha indotto la morte cellulare con EC50 simili in tutti e quattro i tipi di cellule MEF, suggerendo che questi composti inducono la morte cellulare, almeno in parte, dalla famiglia Bcl-2 meccanismi indipendenti (Figura supplementare. S4C).

Per valutare la capacità dell’ABT-263 di indurre direttamente l’apoptosi in una linea cellulare tumorale umana, la traslocazione di Bax e il rilascio di citocromo c sono stati monitorati nella linea cellulare SCLC H146. È stato dimostrato che H146 dipende da Bcl-2 per la sopravvivenza (25). ABT-263 ha indotto una diminuzione dose-dipendente di Bax citosolico accoppiato con un aumento del citocromo c citosolico entro 2 ore dal post-trattamento (Fig. 2C-i). L’enantiomero non è stato in grado di suscitare una risposta simile. L’attivazione di Bax e il rilascio del citocromo c sono stati confermati dalla microscopia (Fig. 2C-ii). L’anticorpo 6A7 anti-Bax, che riconosce specificamente la forma conformazionalmente attiva di Bax, è stato usato per rilevare Bax attivato nelle cellule H146. Coerentemente con gli studi di frazionamento, il trattamento ABT-263 è stato associato a un aumento sostanziale di Bax attivato. Questo corrispondeva al rilascio del citocromo c dai mitocondri al citosol, come evidenziato dalla diminuzione delle strutture punteggiate e dall’aumento della colorazione citosolica. L’ABT-263, ma non il suo enantiomero, ha anche indotto un aumento dipendente dal tempo dell’attività della caspasi-3 che era rilevabile a 2 ore e che ha raggiunto il picco a ∼6 ore (Fig. 2D). Questo effetto era dipendente dalla concentrazione, con un EC50 ∼100 nmol/L al punto di tempo di 6 ore (Fig. 2D, inserto). Al contrario, la camptotecina, un inibitore della topoisomerasi I segnalato per indurre l’apoptosi mitocondriale e la successiva attivazione della caspasi (27, 28), è stata in grado di provocare un aumento dell’attività della caspasi-3 solo dopo 24 ore (dati non mostrati). Questi dati indicano che ABT-263 agisce direttamente per inibire Bcl-2 e Bcl-xL, rilasciando fattori proapoptotici come Bim per indurre una rapida attivazione della via apoptotica mitocondriale.

Per valutare l’ampiezza dell’attività cellulare di ABT-263, è stato esaminato un pannello di linee cellulari tumorali umane che abbraccia una gamma di tipi di tumore. Coerentemente con i precedenti rapporti su ABT-737 (12), ABT-263 ha esibito l’attività del singolo agente in SCLC e tumori maligni ematologici ma non nella maggior parte degli altri tipi di tumore (dati non mostrati). Per indagare più da vicino l’attività all’interno di questi tipi di tumori sensibili, ABT-263 è stato esaminato in pannelli di linee cellulari derivate da SCLC (n = 22) e tumori maligni ematologici (n = 23). In ogni pannello, ABT-263 ha mostrato una gamma di potenza con il 32% (SCLC) e il 48% (ematologico) delle linee cellulari altamente sensibili (EC50 <1 μmol/L; Fig. 3). L’enantiomero era >20 volte meno attivo in queste cellule sensibili (Tabella supplementare S2).

La somministrazione orale di ABT-263 provoca la regressione dei tumori SCLC e ALL xenograft in vivo. Per estendere queste osservazioni in vivo, l’ABT-263 è stato valutato in modelli di xenotrapianto sul fianco stabiliti da alcune delle linee cellulari SCLC ed ematologiche sensibili. Quando dosato p.o., una volta al giorno a 100 mg/kg per 21 giorni consecutivi, ABT-263 ha indotto risposte tumorali rapide e complete (CR) che erano durevoli per diverse settimane dopo la fine del trattamento in tutti gli animali con tumori H889 (SCLC) o RS4;11 (ALL) (Fig. 4A). Un trattamento simile di topi con tumori H146 SCLC ha indotto regressioni rapide con conseguente CR nel 60% e PR nel 40% degli animali (Fig. 4A). Graduale rimbalzo tumorale è stato osservato a partire da diverse settimane dopo la fine del dosaggio in questo modello. L’attività è stata dipendente dalla dose nel modello di xenotrapianto H146. Il trattamento con ABT-263 a 50 mg/kg per 21 giorni consecutivi ha indotto CR nel 22% e PR nel 44% degli animali, mentre 25 mg/kg hanno indotto un’inibizione statisticamente significativa ma modesta della crescita tumorale senza regressioni tumorali osservate. ABT-263 è stato ben tollerato (<5% di perdita di peso) a tutte le dosi.

Per correlare l’esposizione di ABT-263 con l’efficacia antitumorale, è stato fatto uno studio farmacocinetico allo stato stazionario in cui topi non portatori di tumore sono stati dosati p.o. una volta al giorno per 3 giorni, e le concentrazioni plasmatiche del farmaco determinate dopo la terza dose. Sia la concentrazione plasmatica di picco (Cmax) che l’area sotto la curva di concentrazione plasmatica (AUC) erano proporzionali alla dose e aumentavano in modo approssimativamente lineare (Tabella supplementare S3). Una dose di 100 mg/kg, che ha prodotto un tasso di risposta globale del 100% (tasso di risposta globale = CR + PR), ha dato valori Cmax e AUC di 7,7 μmol/L e 90 μmol/L h, rispettivamente. L’esposizione risultante da una dose di 50 mg/kg, che ha prodotto un tasso di risposta globale del 66%, era di 5,4 μmol/L (Cmax) e 54 μmol/L h (AUC). Questi dati indicano che le concentrazioni plasmatiche di picco del farmaco ABT-263 che vanno da ∼5,4 a 7,7 μmol/L sono altamente efficaci.

ABT-263 migliora l’attività degli agenti chemioterapici in vivo. L’efficacia in vivo dell’ABT-263 è stata studiata in combinazione con agenti terapeutici comunemente usati in diversi modelli aggressivi di tumori maligni ematologici. L’ABT-263 e il rituximab sono stati esaminati nel modello xenograft del linfoma a cellule B DoHH2 (Fig. 4B). Quando dosato quotidianamente a 100 mg/kg p.o. per 17 giorni, l’ABT-263 ha mostrato un’inibizione del 44% della crescita tumorale. Una singola dose di 10 mg/kg di rituximab ha prodotto l’84% di inibizione della crescita tumorale. Né l’ABT-263 né il rituximab da soli hanno ottenuto una regressione tumorale sostenuta; tuttavia, la combinazione ha mostrato un effetto superiore, ottenendo il 70% di CR e il 10% di PR. Questa combinazione ha anche portato a un miglioramento significativo del ritardo della crescita tumorale (>700%) rispetto al solo rituximab (300%).

L’efficacia dell’ABT-263 da solo e in combinazione con un regime R-CHOP modificato è stata valutata anche in un modello xenotrapianto del fianco GRANTA-519 di linfoma a cellule mantellari (Fig. 4B). L’ABT-263 somministrato a 100 mg/kg p.o. per 21 giorni consecutivi ha prodotto un’inibizione del 40% della crescita tumorale. In confronto, il regime R-CHOP ha inibito la crescita tumorale del 68% con il 20% di CR. La combinazione ha portato a regressioni tumorali drammatiche e risposte tumorali complete in tutti gli animali testati senza alcuna prova di ricrescita tumorale in quattro dei nove tumori valutabili.

Infine, abbiamo esaminato la capacità dell’ABT-263 di potenziare gli effetti della chemioterapia in un modello resistente all’ABT-263. Nel modello di xenotrapianto del fianco OPM-2 di mieloma multiplo (in vitro EC50 = 6,7 μmol/L), ABT-263 consegnato quotidianamente per 21 giorni a 100 mg/kg non ha inibito significativamente la crescita tumorale (Fig. 4B). Bortezomib consegnato alla sua dose massima tollerata (1 mg/kg i.v., qd ×3) ha inibito la crescita tumorale del 70% senza CRs. ABT-263 ha migliorato l’efficacia di bortezomib con la combinazione risultante in un’inibizione della crescita tumorale del 95% e un tasso di CR del 40%.

ABT-263 induce una trombocitopenia rapida ma reversibile. Abbiamo recentemente segnalato che ABT-737 induce una trombocitopenia rapida e reversibile negli animali risultante dall’inibizione delle proteine della famiglia Bcl-2 e dall’induzione dell’apoptosi nelle piastrine circolanti senza tossicità del midollo osseo (29). Come previsto, ABT-263 induce anche trombocitopenia. Dopo una singola dose p.o. nei cani, la conta delle piastrine circolanti è diminuita entro 2 ore con un nadir piastrinico a 6 ore e prove di rimbalzo entro 24 ore (Fig. 5A). Per determinare gli effetti del dosaggio prolungato, abbiamo esaminato il rapporto farmacocinetico/farmacodinamico in seguito a dosi multiple giornaliere nel cane (Fig. 5B). L’ABT-263 è stato dosato p.o. a 2 mg/kg/d per 6 giorni, e poi aumentato a 6 mg/kg/d per altri 6 giorni. La conta delle piastrine e le concentrazioni plasmatiche del farmaco sono state valutate 6 ore dopo il trattamento per catturare i probabili nadir piastrinici nei giorni da 1 a 4 e nei giorni da 7 a 11. A 2 mg/kg, la conta delle piastrine è diminuita da un valore iniziale di ∼250.000/μL a ∼125.000/μL alla seconda dose, mantenendosi poi stabile per le dosi rimanenti. La concentrazione plasmatica del farmaco ottenuta 6 ore dopo il trattamento (C6h) è rimasta costante a valori che vanno da 3,6 a 4,2 μmol/L. Sulla base del profilo farmacocinetico di ABT-263 (Fig. S1 supplementare), il C6h è circa 2 volte inferiore alla Cmax, indicando che le concentrazioni plasmatiche di picco del farmaco raggiunte dopo dosi multiple di 2 mg/kg sono ∼7 a 8 μmol/L. Questi livelli sono simili a quelli ottenuti dopo una dose di 100 mg/kg p.o. nei topi. Quando la dose di ABT-263 è stata aumentata a 6 mg/kg/d, la conta delle piastrine è diminuita a ∼50.000/μL entro il secondo giorno di questa dose più alta ed è rimasta relativamente costante per la durata dello studio. I valori di C6h a questo livello di dose variavano da 10,2 a 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). L’ABT-263 è stato ben tollerato in questo studio senza mortalità o segni clinici avversi. Tuttavia, alcuni ematomi erano evidenti al sito di venipuntura, coerenti con alterazioni dell’emostasi. Questi dati indicano che l’esposizione giornaliera ripetuta di ABT-263 a livelli che hanno dimostrato di essere altamente efficaci nei modelli murini si traduce in una riduzione del ∼50% delle piastrine circolanti nei cani. Inoltre, le concentrazioni plasmatiche di gran lunga superiori al livello efficace sono ben tollerate, con la conta delle piastrine circolanti ridotta a ∼50.000/μL.