Sommario
L’ultracentrifugazione a gradiente di densità del saccarosio è una tecnica potente per frazionare macromolecole come DNA, RNA e proteine. A questo scopo, un campione contenente una miscela di macromolecole di dimensioni diverse viene stratificato sulla superficie di un gradiente la cui densità aumenta linearmente dall’alto verso il basso. Durante la centrifugazione, macromolecole di dimensioni diverse sedimentano attraverso il gradiente a tassi diversi. Il tasso di sedimentazione dipende, oltre che dalla forza centrifuga, dalla dimensione, dalla forma e dalla densità delle macromolecole, così come dalla densità e dalla viscosità del gradiente. In questo modo, le macromolecole vengono separate in base alle dimensioni, con quelle più grandi che sedimentano verso il fondo e quelle più leggere che rimangono vicino alla parte superiore del gradiente. Il metodo ha avuto particolare successo nel frazionamento dimensionale di grandi molecole di DNA ed è stato ampiamente utilizzato per misurare l’induzione e la riparazione delle rotture del DNA dopo l’esposizione a fattori clastogenici. Qui, descriviamo un adattamento di questo metodo che può essere utilizzato nell’analisi del DNA appena sintetizzato formato durante la replicazione del DNA. Attraverso l’analisi delle dimensioni del DNA nascente in gradienti di saccarosio alcalino, le variazioni dell’attività di replicazione possono essere misurate dopo l’esposizione delle cellule ad agenti dannosi per il DNA. Il metodo è particolarmente utile perché permette di distinguere tra gli effetti mediati dal danno al DNA sull’allungamento della catena e l’iniziazione del replicone, che è essenziale per un’analisi approfondita del checkpoint intra-S-fase. Questa capacità rende la tecnica unica e giustifica la sua natura un po’ laboriosa.