Biosintesi di trans-4-idrossiprolina da ceppi ricombinanti di Corynebacterium glutamicum ed Escherichia coli

Costruzione di ceppi ricombinanti produttori di trans-Hyp

Nel database ci sono diversi geni ipotizzati come geni putativi di L-prolina 4-idrossilasi, compresi i geni in Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 e Dactylosporangium. sp. Usando PCR, abbiamo clonato e ottenuto i geni putativi di P4H da P. stutzeri e B. bronchiseptica RB50, chiamati p4hP e p4hB. Sono stati legati ai plasmidi corrispondenti dopo la digestione e convertiti in C. glutamicum ed E. coli, rispettivamente. La lunghezza di p4hP era di 918 bps mentre p4hB era di 924 bps. Queste sequenze erano identiche al 100% ai geni riportati in NCBI. Il gene di trans-P4H da Dactylosporangium sp. (p4hD) è stato espresso in E. coli con successo e può trasformare L-prolina con buone proprietà enzimatiche. La lunghezza di p4hD era 816 bps che codificava un polipeptide di 272 aminoacidi con il peso molecolare di 29.715 dalton. In questo studio, p4hD è stato applicato con alcune modifiche sulle basi nucleari. La sequenza originale del gene p4hD è stata analizzata (http://www.kazusa.or.jp/codon/) e i risultati hanno mostrato che c’erano alcuni codoni rari sia per C. glutamicum che per E. coli. È stato riportato che i codoni rari sono fortemente associati con un basso livello di espressione della proteina. L’ottimizzazione dei codoni per l’espressione della proteina eterologa ha spesso dimostrato di aumentare drasticamente l’espressione della proteina. Così, i codoni rari del gene p4hD sono stati sostituiti per quelli utilizzati con alta frequenza in C. glutamicum e il contenuto GC è stato regolato dal 73% al 61% attraverso la conversione sinonima, che era vicino a quello di C. glutamicum. Il gene modificato di p4hD è stato sintetizzato secondo le modifiche di cui sopra (file aggiuntivo 1).

L’espressione di P4H è uno degli aspetti importanti sulla costruzione della via biosintetica trans-Hyp. La figura 2 mostra la SDS-PAGE di trans-P4Hs espresso in C. glutamicum ricombinante e E. coli. Tutte le trans-P4H ricombinanti sono state espresse come proteine solubili senza corpi di inclusione. Era ovviamente che le trans-P4H ricombinanti in E. coli erano espresse molto di più di quelle in C. glutamicum (Figura 2). Molti fattori influenzano l’espressione delle proteine estranee, compresi i promotori, il sistema ospite-vettore e le condizioni culturali, ecc. Poiché è stato il primo ad esprimere trans-P4Hs in C. glutamicum, studi più completi come la selezione del promotore e l’ottimizzazione delle condizioni di coltura saranno considerati nel nostro lavoro futuro.

Confronto delle attività di P4H

Le ossigenasi sono ampiamente applicate nell’industria poiché possono catalizzare l’ossifunzionalizzazione altamente specifica di legami C-H non attivati in condizioni miti, in particolare trasferendo ossigeno molecolare a un substrato. La P4H appartiene a una famiglia di diossigenasi dipendenti da 2 ossiacidi, che è una proteina monomerica e utilizza i substrati monomerici piuttosto che polimerici. In questo studio sono state misurate le attività delle trans-P4H utilizzando cellule intere ricombinanti (tabella 1). I nostri dati hanno indicato che il livello di proteina espressa e l’attività enzimatica erano più alti a 30°C. I risultati hanno anche mostrato che i plasmidi erano molto stabili, dato che le stabilità dei plasmidi dei ceppi ricombinanti di E. coli e C. glutamicum erano tutte superiori al 98% alla fine della fermentazione.

Le cellule ricombinanti con espressione di diversi geni hanno mostrato diversi livelli di attività catalitica verso la L-prolina. L’attività di trans-P4H espressa da E. coli BL21/ pET28a-p4hD era la più alta tra tutti i ceppi ricombinanti costruiti. Anche i nuovi geni clonati ed espressi da P. stutzeri e B. bronchiseptica hanno mostrato attività interessate. Per quanto riguarda i diversi ceppi ospiti, E. coli ha rappresentato meglio di C. glutamicum, il che può essere legato alle prestazioni del plasmide corrispondente. Quattro ceppi produttori di L-prolina di C. glutamicum sono stati utilizzati come ceppi ospiti di espressione e i ceppi ricombinanti risultanti hanno mostrato diverse attività enzimatiche. La più alta attività enzimatica specifica tra i ceppi di C. glutamicum è stata di 40,7 U/mg – cellula bagnata da C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Tuttavia, l’attività enzimatica specifica di E. coli ricombinante/pET28a -p4hD era fino a 60,4 U/mg – cellula umida. La crescita dei tre ceppi ricombinanti di E. coli era simile. Ma c’era una differenza significativa tra i ceppi ricombinanti di C. glutamicum. I ceppi ricombinanti di C. glutamicum con attività enzimatiche specifiche più elevate sono cresciuti meno di quelli con attività enzimatiche specifiche più basse. Inoltre, l’attività enzimatica di E. coli BL21 /pET28a -p4hD era simile a quella di E. coli W1485/pWFH1 e superiore a quella di E. coli BL21/pET24-p4h1 di . La p4hD in E. coli W1485/pWFH1 era quella originale in Dactylosporangium sp. Anche se l’ottimizzazione del codone in questo studio è stato progettato per C. glutamicum, i risultati hanno indicato che è stato anche con successo in E. coli.

La produzione di trans-Hyp in fiaschette

La produzione di trans-Hyp da diversi ceppi ricombinanti di C. glutamicum e E. coli è stata anche mostrata nella tabella 1. Le rese di trans-Hyp da questi ceppi ricombinanti dipendevano sia dall’attività enzimatica di P4H che dalla crescita cellulare. E. coli BL21/ pET28a-p4hD ha avuto la resa più alta, che coincideva con la sua attività enzimatica specifica. Anche se i ceppi ricombinanti di E. coli sono cresciuti in modo simile nel mezzo di produzione, c’era una differenza significativa nella produzione di trans-Hyp che non ha mantenuto lo stesso livello con le attività enzimatiche specifiche. Le produzioni di trans-Hyp dai ceppi ricombinanti di C. glutamicum erano anche molto inferiori a quelle di E. coli BL21/pET28a-p4hD. Ciò era dovuto sia alla minore espressione di trans-P4H che alla minore crescita cellulare in C. glutamicum. La produzione di L-prolina di quattro ceppi di C. glutamicum era anche inferiore a 1 g/L. C’era poca differenza di produzione di trans-Hyp tra i ceppi ricombinanti di C. glutamicum con lo stesso gene p4hD, nonostante alcuni ceppi avessero migliori prestazioni enzimatiche e produzione di prolina.

L’utilizzo dei ceppi ricombinanti per sintetizzare direttamente trans-Hyp dal glucosio attraverso la fermentazione è stato ottenuto poiché erano disponibili sia gli enzimi che i precursori necessari nel processo. Il trans-P4Hs straniero sovraespresso ha catalizzato l’idrossilazione della L-prolina nella posizione trans-4, mentre il 2-chetoglutarato è stato fornito dal glucosio attraverso il ciclo TCA e poi decarbossilato ossidativamente a succinato (Figura 1). È stato riportato che la prolina è stata richiesta nella produzione di Hyp da E. coli ricombinante solo con il gene p4h. Il carbonio in prolina aggiunto durante la fermentazione confluiva solo negli aminoacidi sintetizzati dagli intermedi del ciclo TCA e non nella gluconeogenesi. Tuttavia, l’Hyp accumulato era ad un livello relativamente alto anche senza l’aggiunta di prolina in questo studio. Si poteva capire che il Corynebacterium aveva la potente via biosintetica della prolina. La via biosintetica della prolina è stata identificata anche in E. coli, che può contribuire alla sintesi di trans-Hyp dai ceppi ricombinanti di E. coli. La modifica della via della prolina in E. coli ha migliorato la resa di Hyp, mentre la formazione di Hyp può anche alleviare l’inibizione di feedback della prolina. La quantità di prolina (0-4 mM) ha promosso la produzione di trans-Hyp. Tuttavia, l’aggiunta continua di L-prolina non ha migliorato significativamente la resa di produzione (tabella 2). In questo studio, il tempo di coltivazione è stato significativamente inferiore a quelli riportati nella letteratura, il che potrebbe essere attribuito ai diversi media utilizzati e ha anche indicato che c’era un grande potenziale con l’ottimizzazione. Infatti, 2,28 g/L di trans-Hyp è stato prodotto da E. coli ricombinante senza aggiungere L-prolina in fiasche con una piccola modifica dei media e 6,72 g/L è stato raggiunto integrando solo 4 mM L-prolina.

Al fine di aumentare ulteriormente la biosintesi di trans-Hyp da C. glutamicum ricombinante ed E. coli, dovrebbero essere considerati anche approcci alternativi. In E. coli, la degradazione della prolina dovrebbe essere superata. Anche se la produzione di trans-Hyp da un mutante putA di E. coli non è stata migliorata ulteriormente, il rendimento basato sulla prolina utilizzata è stato notevolmente aumentato. Sia in C. glutamicum che in E. coli, l’espressione di P4H ricombinante come una delle ossigenasi è coinvolta nel metabolismo fisiologico delle cellule ospiti, compreso il cofattore, il co-substrato e l’ossigeno. Inoltre, senza una potente via sintetica di prolina in E. coli, la disponibilità e il trasporto del substrato limiteranno seriamente la trasformazione.