ORIGINAL PAPERS
Descrizione di un focolaio diffuso di meningite asettica dovuta all’echovirus 30 nello stato di Rio de Janeiro, Brasile
Vitor Laerte Pinto JuniorI; Maria Cristina RebeloII; Eliane Veiga da CostaIII; Edson Elias da SilvaIII; Márcio Neves BóiaIV
IDiretoria Regional de Brasília, Fiocruz, Brasília, DF
IILaboratório de Referência Estadual para Meningites, Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião, Rio de Janeiro, RJ
IIILaboratório de Enterovirus, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ
IVPós-graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ; Brasile
Indirizzo per la corrispondenza
ABSTRACT
Echovirus 30 appartiene al genere Enterovirus ed è ampiamente associato alle epidemie di meningite asettica (AM). In Brasile sono state segnalate epidemie dovute a questo sierotipo in diversi stati ma a Rio de Janeiro, prima di questo studio, era coinvolto solo in episodi sporadici. Abbiamo raccolto retrospettivamente i dati da cartelle di notifiche AM e database di isolamento di enterovirus da Rio de Janeiro State Health Department (RJSHD) e Enterovirus Reference Laboratory nell’anno 2005. Un focolaio di AM è stato rilevato durante marzo, aprile e maggio associato ad un alto tasso di isolamento di coltura cellulare per echovirus 30 (17.4%). I bambini maschi di età variabile da 1 a 9 anni erano più colpiti. Dei 22 pazienti con malattia confermata da echovirus 30, le informazioni cliniche erano disponibili in otto; febbre, mal di testa e vomito erano le manifestazioni più comuni. L’analisi del liquor ha mostrato un modello tipico di infezione virale con una mediana di cellularità di 100 cellule/mm3 e una predominanza di cellule mononucleari nel 64,7% dei casi. La mediana dei livelli di proteine e di glucosio di 49 mg/dL e 56,5 mg/dL. Il tasso di mortalità era nullo. Nonostante il suo decorso benigno e la mancanza di opzioni di trattamento, la sorveglianza della meningite asettica è fondamentale per l’identificazione precoce degli agenti causali dei focolai, che aiuta ad evitare ulteriori test e l’uso inappropriato di antimicrobici.
Parole chiave: Meningite asettica, enterovirus, echovirus, liquido cerebrospinale.
La meningite asettica (AM) è una sindrome caratterizzata dall’insorgenza acuta di febbre e meningismo insieme all’analisi del liquido cerebrospinale (CSF) che presenta tipicamente una predominanza di cellule mononucleate e indagini batteriologiche negative. Attualmente, con la diffusione dei vaccini virali (principalmente polio, parotite e morbillo), l’enterovirus non polio è diventato la principale causa di AM infettiva, essendo responsabile di casi sia sporadici che epidemici. La diagnosi di enterovirus non polio in Brasile è limitata ai centri di ricerca in cui i campioni clinici sono testati per scopi di sorveglianza epidemiologica solo attraverso la cultura virale o PCR.
Echovirus 30 appartiene al genere Enterovirus ed è associato principalmente a casi di AM con un modello epidemico. Questo sierotipo ha aumentato la sua incidenza e negli ultimi anni è tra gli enterovirus più frequentemente rilevati. In Brasile è stato già segnalato come l’agente causale di focolai di AM in diversi stati (Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Pernambuco e Pará), che colpisce più comunemente i bambini più grandi e gli adulti e con un basso rapporto di mortalità.
Tra marzo e maggio 2005, un focolaio di AM si è verificato nell’area metropolitana dello stato di Rio de Janeiro in concomitanza con livelli superiori alla norma di isolamento confermato di echovirus 30 dal CSF e dalle feci dei pazienti con questa sindrome. I dati clinici, di laboratorio ed epidemiologici sono riportati in questo studio.
Materiale e metodi
Soggetti
In questo studio retrospettivo i dati epidemiologici e demografici di 573 casi notificati di AM nel 2005 sono stati rivisti e analizzati dal database del comitato consultivo meningite del Dipartimento della salute dello stato di Rio de Janeiro (RJSHD). La AM è stata considerata in tutti i casi con i seguenti criteri: pazienti di qualsiasi età con sintomi di meningite acuta (febbre, mal di testa, vomito, rigidità nucale e irritabilità o letargia) insieme a un profilo del CSF che mostra un numero di globuli bianchi > 10 cellule/mm3 e un’indagine batteriologica negativa.
I dati clinici dei pazienti assistiti presso l’Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião (IEISS), Rio de Janeiro, con infezione confermata da echovirus 30 sono stati ottenuti dalle cartelle dei pazienti e dal database dell’Enterovirus Reference Laboratory. Sono stati raccolti dati su età, sesso, segni e sintomi, comorbidità, risultati iniziali dell’analisi del CSF e risultati clinici al momento della dimissione dall’ospedale.
Analisi del CSF dei campioni clinici
Tutti i pazienti sono stati sottoposti a una puntura lombare per la valutazione della meningite; nessun paziente è stato sottoposto a questa procedura solo allo scopo di raccogliere campioni per lo studio. Il CSF è stato analizzato per il contenuto cellulare, i livelli di proteine e glucosio e i test batteriologici utilizzando i metodi di routine del laboratorio.
Isolamento e identificazione del virus
Tutti i campioni (CSF ed estratti fecali dai pazienti che indagano sulla AM) sono stati inoculati in volumi di 0,2 mL su colture cellulari allo scopo di isolare il virus. Le linee cellulari continue RD (rabdomiosarcoma umano) e HEp2 (carcinoma laringeo umano) sono state selezionate per la sua capacità di sostenere la maggior parte dei sierotipi di Enterovirus replicazione. Le provette sono state mantenute a 36ºC per sette giorni, sottoposte a un passaggio alla cieca e mantenute a 36ºC per altri sette giorni. Le colture cellulari che dimostravano l’effetto citopatico (CPE) sono state tenute a -20ºC fino a ulteriore identificazione.
I campioni che mostravano Enterovirus caratteristica CPE sono stati sottoposti a estrazione di RNA utilizzando Trizol LS ® (Life Technologies), secondo il protocollo del produttore. Specifica Enterovirus gruppo-RT-Polymerase Chain Reaction è stata eseguita utilizzando una coppia di primer (R – 222 e F – 292) che amplifica un frammento 357 bp all’interno del gene che codifica per la proteina del capside principale, VP1, come descritto da Oberste et al. Dopo 30 cicli di denaturazione a 95ºC / 2”, ricottura a 42ºC / 4” ed estensione a 60ºC / 3”, in un termociclatore GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems), i prodotti sono stati analizzati mediante elettroforesi in un gel di agarosio all’1% contenente bromuro di etidio (0,5 mg/mL), utilizzando 50 bp ladder (Invitrogen), come marker di peso molecolare e visualizzati in un transiluminatore (luce UV). I prodotti specifici sono stati purificati su gel utilizzando il kit “QIAquick® Gel Extraction” (Qiagen) e poi quantificati per confronto, in gel di agarosio all’1%, con il marker di massa molecolare Low DNA Mass Ladder (Invitrogen).
Le reazioni di cycle-sequencing sono state eseguite utilizzando l’ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied-Biosystems) in un termociclatore GeneAmp®, con cicli di 1” a 95ºC, 3” a 42ºC e 3′ a 60ºC. I prodotti di sequenza ottenuti utilizzando entrambi i primer (222 e 292) in reazioni individuali, sono stati purificati mediante precipitazione con alcol isopropilico e analizzati utilizzando l’analizzatore genetico ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). I sierotipi di Enterovirus sono stati ottenuti confrontando le sequenze con quelle presenti in GenBank utilizzando il programma Blast .
Costruzione del diagramma endemico e analisi statistica
Tutti i dati provenienti dalle cartelle dei pazienti e dal RJSHD sono stati inseriti e analizzati utilizzando il software statistico SPSS, versione 13.0 per windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Sono stati eseguiti strumenti di statistica descrittiva (media, mediana e deviazione standard). L’incidenza annuale della meningite asettica è stata valutata utilizzando come denominatore i dati della popolazione presi dalla stima del 2007 dall’Istituto Brasiliano di Geografia e Statistica (IBGE).
Per la costruzione del diagramma endemico della AM a Rio de Janeiro, sono stati analizzati i casi notificati di AM tra gli anni 2000-2004. La media e la deviazione standard della distribuzione di frequenza dei casi per ogni mese dell’anno sono stati ottenuti e poi è stato aggiunto a ogni mese media sua SD moltiplicato per 1,96 (z di una distribuzione normale con sensibilità 95%) per costruire il limite superiore del diagramma che ha rappresentato la soglia epidemica.
Etica
Questo studio è stato progettato secondo le leggi brasiliane sulla ricerca che coinvolge esseri umani ed è stato approvato dal Comitato Etico dell’Istituto di Ricerca Clinica Evandro Chagas, FIOCRUZ, Rio de Janeiro.
Risultati
Dati demografici ed epidemiologici
Un totale di 573 casi di meningite asettica sono stati notificati nel 2005 nello stato di Rio de Janeiro; l’incidenza era di 3,71 casi/100.000 abitanti. I dati sulla distribuzione per età e sesso sono riportati nella tabella 1. La maggior parte dei casi si è verificata nei bambini tra uno e nove anni; in questo gruppo di età i maschi hanno rappresentato il 60,7% dei casi mentre le femmine il 39,3%. Al di sopra di questo gruppo di età la predominanza di genere non è stata osservata.
I casi di AM si sono verificati durante tutto il periodo studiato concentrandosi nella regione metropolitana di Rio de Janeiro. La distribuzione di frequenza dei casi di AM mostra un periodo epidemico tra i mesi di marzo e maggio (Figura 1). Il periodo iniziale dell’epidemia è iniziato a marzo con 99 casi (previsto 36 casi), l’apice si è verificato in aprile con 122 casi (previsto 38) e la fine in maggio con 58 casi (previsto 39). In Brasile questo periodo corrisponde alla fine dell’estate e all’inizio dell’autunno.
Isolamento e identificazione dell’enterovirus
Durante l’anno 2005, 171 campioni di CSF e feci da casi AM sono stati analizzati per l’enterovirus, il numero di campioni inviati per l’isolamento del virus variava in questo periodo da nessuno a 85 per mese; dei 48 (28.0% del totale dei campioni inviati) non polio enterovirus isolati, l’echovirus 30 è stato identificato in 17 CSF e 5 feci (45,8% dei campioni positivi). L’identificazione di questo agente è avvenuta esclusivamente nel periodo epidemico e il suo tasso medio di isolamento è stato del 17,4% (22/126). L’enterovirus non poliomielitico non sequenziato è stato rilevato al di fuori del periodo epidemico negli altri 26 (54,2%) campioni di CSF (Figura 2).
Aspetti clinici
Tra i 22 pazienti con malattia confermata da echovirus 30, i dati clinici erano disponibili in otto e i risultati delle analisi CSF in tutti i diciassette campioni CSF. C’era una predominanza maschile (54,5%) con età variabile da 2 a 36 anni (mediana di 4,5 anni). Le manifestazioni più comuni erano mal di testa, 100,0% (8/8); febbre, 87,5% (7/8); vomito, 62,5% (5/8); e rigidità nucale, 52,5% (5/8). L’analisi del CSF ha dimostrato una pleocitosi con una mediana di 100 leucociti/mm3 (da 32 a 325 leucociti/mm3) con predominanza di cellule mononucleari nel 64,7% (11/17). Il livello delle proteine era leggermente elevato con una mediana di 49 mg/dL (da 28 a 84 mg/dL) e un livello mediano di glucosio di 56,5 mg/dL (da 43 a 92 mg/dL). Il tasso di fatalità era nullo.
Discussione
Il nostro studio riporta il primo focolaio di echovirus 30 correlato nello stato di Rio de Janeiro, che si è verificato nell’anno 2005, mostrando i suoi aspetti clinici, di laboratorio ed epidemiologici. Questo focolaio è iniziato in marzo con progressione fino alla fine di aprile e ritorno ai livelli endemici in giugno.
La meningite asettica è una sindrome con un’ampia lista di possibili agenti eziologici, ed è molto sottostimata in Brasile; nel nostro ambiente le difficoltà nell’eseguire la diagnosi eziologica nella pratica clinica risiedono negli alti costi dei test e nella competenza tecnica richiesta. Tuttavia, diversi studi che hanno indagato le eziologie della AM in diverse regioni del mondo negli ultimi 30 anni hanno trovato che gli enterovirus non polio sono responsabili della maggior parte dei casi che variano in frequenza dal 52% al 92%.
Nel nostro studio, la distribuzione per sesso ed età dei casi di AM ha mostrato un modello simile descritto in altri studi sulla malattia del sistema nervoso centrale causata da enterovirus, con una predominanza maschile e che colpisce i bambini da 1 a 9 anni. La ragione della predominanza maschile non è nota, ma si ipotizza che questo genere abbia un maggior grado di esposizione ai fattori di rischio coinvolti nella trasmissione.
I casi di AM nelle aree a clima temperato sono segnalati per avere una distribuzione stagionale con un picco di incidenza in estate, probabilmente associato al periodo di vacanze scolastiche e attività ricreative. Nelle aree tropicali e subtropicali, i casi di AM hanno una distribuzione uniforme lungo l’anno come mostrato nel diagramma endemico costruito nel nostro studio. In uno studio precedente, dos Santos et al. hanno mostrato un modello simile, ma c’era una tendenza per i casi a verificarsi in periodi di temperature più elevate.
Echovirus 30 ha un modello epidemico di occorrenza, e AM è la sua sindrome più comunemente riportata. Questo sierotipo è stato responsabile, negli anni precedenti, di focolai di AM in diversi stati brasiliani (Paraná, Rio Grande do Sul, Pernambuco e Pará), sempre con decorso clinico ed esito benigno. In altre regioni del mondo, l’echovirus 30 è già il sierotipo più frequentemente isolato dal CSF di pazienti con AM e i dati di sorveglianza degli Stati Uniti indicano che l’echovirus 30 ha causato grandi focolai, intercalati da periodi di quiescenza. Gli studi di epidemiologia molecolare eseguiti durante i focolai hanno evidenziato cinque diversi genotipi di echovirus 30, che è la spiegazione proposta per questo comportamento epidemiologico.
Nello stato di Rio de Janeiro la circolazione di echovirus 30 in associazione con casi sporadici di AM è stata segnalata dal 2001. Nel 2005 tra i mesi di marzo e maggio è stato osservato un aumento dei casi notificati di AM al di sopra del livello epidemico per quel periodo. Contemporaneamente l’echovirus 30 è stato isolato da campioni clinici inviati al Laboratorio Enterovirus in una proporzione di gran lunga superiore (17,4%) a quella considerata normale per i casi sporadici, che è inferiore al 10%. Questo alto tasso di isolamento era simile a quello descritto in un focolaio associato all’echovirus 30 a Taiwan nel 2001. Questi fatti confermano il verificarsi di un focolaio causato da echovirus 30 per la prima volta nello stato.
Clinicamente abbiamo osservato la tipica sindrome di meningite con l’insorgenza improvvisa di febbre e mal di testa come le manifestazioni più comuni. Il tasso di mortalità era nullo tra i pazienti con malattia confermata da echovirus 30, il che dimostra il decorso benigno della malattia. Tuttavia, una valutazione neurologica prospettica di questi casi sarebbe necessaria per escludere sequele neurologiche a lungo termine.
I dati di sorveglianza presentati in questo studio rappresentano tutti i casi notificati, compresi quelli probabilmente non causati da enterovirus, poiché altri agenti causali non sono rari nel nostro paese, come Leptospira sp., virus della dengue, Bartonella sp. e virus Herpes simplex . I dati epidemiologici sugli agenti eziologici responsabili della AM a Rio de Janeiro sono in gran parte sconosciuti, quindi la reale estensione del coinvolgimento degli enterovirus nei casi di AM nel nostro ambiente è una questione irrisolta. Un altro aspetto importante che non siamo stati in grado di descrivere in questo focolaio è stato il modo di trasmissione della malattia; gli enterovirus sono acquisiti nella grande maggioranza dei casi per contaminazione fecale-orale, che potrebbe essere legata al contatto con una fonte comune, come cibo e acqua, o per contatto da persona a persona. Entrambi i meccanismi potrebbero essere stati responsabili della propagazione dei casi nel nostro studio, tuttavia i limiti metodologici imposti dal disegno retrospettivo non hanno permesso questa analisi.
Echovirus 30 è associato a focolai di meningite asettica con un esito benigno; si prevede un aumento della frequenza di questo sierotipo in Brasile che si manifesta con grandi focolai di AM tra periodi di quiescenza. Intensificare e migliorare la sorveglianza dell’AM è fondamentale per l’identificazione precoce degli agenti causali dei focolai, che aiuta ad evitare ulteriori test e l’uso non necessario di antimicrobici. Altri studi sono necessari per stabilire altri agenti causali di AM in Brasile e per chiarire i loro meccanismi di trasmissione.
Riconoscimenti
A Maria de Fátima Calderaro del RJSDH per aver fornito i dati di sorveglianza epidemiologica.
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