Due residui aminoacidici determinano la sensibilità 2-APB dei canali ionici TRPV3 e TRPV4

Risultati

Identificazione delle mutazioni che influenzano specificamente le risposte 2-APB.

Abbiamo esaminato una libreria di mutanti TRPV3 del topo costituita da ≈14.000 costrutti di cDNA che portano in media 2,5 mutazioni per clone generato dalla PCR soggetta a errori. Costrutti mutanti sono stati trasfettati in cellule di rene embrionale umano (HEK293), e le risposte di calcio evocate dal calore (42 ° C), 25 μM 2-APB, e 1,75 mM canfora sono stati monitorati in un lettore di piastra di imaging a fluorescenza (FLIPR). Abbiamo recentemente descritto l’identificazione dei residui specificamente richiesti per l’attivazione termica TRPV3 (20). Qui, ci siamo concentrati sul set di dati 2-APB e canfora per identificare i residui specificamente richiesti per le risposte chimiche.

Specificamente, abbiamo selezionato i cloni che hanno mostrato risposte normali per una sostanza chimica, ma significativamente ridotta attivazione dall’altro (per i criteri di selezione, vedi Metodi). I cloni positivi sono stati raccolti, fatti ricrescere, e sono state misurate le curve dose-risposta complete contro ogni stimolo, e sono stati calcolati i valori EC50 (vedi Metodi). Sette cloni mutanti sono stati confermati come specificamente carenti di 2-APB e sequenziati. Notevolmente, tutti e 7 i cloni includevano mutazioni in 1 di 2 residui. Il primo, l’istidina (H) 426, è presente nella regione citoplasmatica del terminale N, tra i domini anchirinici e transmembrana. Abbiamo identificato 4 sostituzioni distinte di H426 nello schermo (Tabella 1). La seconda, arginina (R) 696 è presente all’interno del C-terminale citoplasmatico TRP box (IWRLQR), un dominio conservato nei canali TRP (2, 3). Le 3 mutazioni a questo residuo hanno la stessa sostituzione arginina-lisina strettamente correlata. Tutte e 7 le mutazioni hanno causato gravi deficit nelle risposte 2-APB, senza influenzare le risposte canfora (Tabella 1). Sebbene siano stati identificati anche alcuni cloni carenti di canfora, si trattava di mutazioni relativamente più sottili, che spostavano i valori EC50 della canfora ≈2 volte o meno (dati non mostrati). Per questo motivo, abbiamo focalizzato questo studio sui 2 residui che causano specificamente >10 volte il deficit di 2-APB.

Caratterizzazione elettrofisiologica iniziale dei canali TRPV3-H426 e TRPV3-R696.

FLIPR è un modo indiretto di misurare l’attività del canale ionico. Per confermare i nostri risultati FLIPR, abbiamo usato la tecnica del patch clamp e misurato le correnti di cellule intere del topo wild-type TRPV3, TRPV3-H426N, e TRPV3-R696K quando 2-APB (1 μM a 3 mM) o canfora (0,3 a 20 mM) sono stati singolarmente bagno applicato da basse ad alte concentrazioni (Fig. 1 e Fig. S1). In modo concentrazione-dipendente, 2-APB attivato correnti in cellule HEK293 trasfettati con wild-type TRPV3 con valori medi EC50 di 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) e 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) a +100 e -100 mV, rispettivamente (Fig. 1A; Fig. S1A); 2-APB non ha indotto correnti misurabili in cellule HEK293 trasfettate con TRPV3-H426N fino a 100 μM. Tuttavia, concentrazioni di 2-APB che sono saturanti per TRPV3 wild-type (0,3 a 3 mM) sono stati in grado di attivare correnti in questo mutante in modo concentrazione-dipendente (Fig. 1A; Fig. S1A). Di conseguenza, il TRPV3-H426N ha mostrato un >10 volte spostamento EC50 di 2-APB-dipendente attivazione, e la risposta non ha mai raggiunto la saturazione. In esperimenti paralleli, la canfora anche attivato correnti in cellule HEK293 trasfettate con wild-type TRPV3 in modo dipendente dalla concentrazione con valori EC50 di 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) e 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) a +100 e -100 mV, rispettivamente. Soprattutto, wild-type-come risposte alla canfora sono stati osservati in cellule HEK293 trasfettati con il TRPV3-H426N , confermando che l’attivazione canfora è inalterato in questo mutante (Fig. 1A; Fig. S1B).

In cella intera patch-clamp esperimenti, 2-APB anche indotto minimo TRPV3-R696K attivazione. A +100 mV, 2-APB ha iniziato ad attivare le cellule HEK293 che esprimono questo canale mutante a ≈3 μM, e ha raggiunto la saturazione a 30 μM, con un EC50 di 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Concentrazioni più elevate di 2-APB (>30 μM) hanno evocato una corrente desensibilizzante con una “off-response” dopo il washout di 2-APB, un fenomeno che è descritto in dettaglio di seguito. Tuttavia, a -100 mV, 2-APB non è riuscito ad attivare i canali mutanti R696K anche a 1 mM (Fig. 1B; Fig. S1A). Il massimo 2-APB risposta a 1 mM a -100 mV era -2,3 ± 1,4 pA / FP (n = 6), che è significativamente più piccolo (> 10 volte) rispetto ai canali wild-type TRPV3 (-482,1 ± 69,2 pA / FP a 300 μM, n = 17), suggerendo che la risposta massima canale evocato da 2-APB è diminuita nel TRPV3-R696K mutante. Tuttavia, canfora attivato risposte simili a TRPV3- e TRPV3-R696K-transfected cellule HEK293 (Fig. 1B; Fig. S1B). Pertanto, i dati elettrofisiologici iniziali hanno confermato i nostri risultati di screening che TRPV3-H426N e TRPV3-R696K mutanti sono carenti nella reattività 2-APB, senza influenzare la funzione generale del canale come testato dalla loro capacità di rispondere alla canfora.

Abbiamo chiesto quali proprietà della catena laterale di H426 e R696 sono cruciali per l’attivazione TRPV3 da 2-APB. Abbiamo mutato individualmente le posizioni 426 e 696 in tutti gli altri aminoacidi e misurato le curve dose-risposta FLIPR sia per 2-APB che per la canfora. È interessante notare che tutti i mutanti H426 avevano risposte diminuite di 2-APB con un forte (>10 volte) aumento dei valori EC50 (Tabella S1). La maggior parte dei mutanti ha avuto risposte normali alla canfora, tranne che per la sostituzione prolina helix-breaking, che ha mostrato un aumento di ≈2 volte dell’EC50 della canfora. I dati sono coerenti con il risultato del nostro schermo primario che ha identificato 4 diverse sostituzioni con conseguente carenza di 2-APB in questa posizione. I canali mutanti che portano catene laterali aromatiche F, T e W non hanno risposto né alla canfora né al 2-APB. Tuttavia, la maggior parte dei mutanti R696 hanno mostrato risposte ridotte alla 2-APB, ma anche risposte massime diminuite alla canfora (20 mM), indicando che queste mutazioni influenzano l’espressione o la funzione generale del canale (Tabella S2). Questo risultato è anche coerente con il nostro risultato iniziale dallo schermo primario, dove solo la sostituzione della lisina è stato identificato per essere specificamente richiesto per 2-APB a questo residuo. R696F ha anche mostrato qualche deficit 2-APB-specifico, anche se le risposte massime di canfora erano leggermente influenzate. I mutanti R696D, R696G, R696N, R696P, R696S e R696T non hanno mostrato risposte significative né alla 2-APB né alla canfora rispetto alle cellule trasfettate con il vettore pcDNA.

La risposta dipendente dalla tensione è rimasta intatta nei mutanti 2-APB.

È stato dimostrato che la dipendenza dalla tensione ha un ruolo importante nell’attivazione e nel gating dei canali TRP (1, 10-12, 21). In assenza di stimolatori chimici (per esempio canfora o 2-APB), passi di tensione da -120 a +180 mV (passo 20 mV) non ha attivato correnti in cellule HEK293 trasfettati con wild-type TRPV3, indicando che TRPV3 (a differenza di TRPV1 e TRPM8) non è attivato da tensione solo alla gamma testato qui (20, 22). Tuttavia, in presenza di 30 μM 2-APB, una tensione-dipendente corrente è stato attivato (Fig. S2A). Come previsto, non rilevabile tensione modulata corrente è stato visto in TRPV3-H426N quando trattati con 30 micron 2-APB (Fig. S2B). Tuttavia, 6 mM canfora evocato una tensione-dipendente corrente in cellule HEK293 esprimendo wild-type TRPV3 (V1 / 2 di 81,3 ± 2,6 mV) (Fig. S2 A e D) e TRPV3-H426N (V1 / 2 di 81,3 ± 2,5 mV) (Fig. S2 B e D). Simile a TRPV3-H426N, non vi era rilevabile tensione modulata corrente in TRPV3-R696K quando trattati con 30 μM 2-APB (Fig. S2C). Tuttavia, la canfora ha attivato una corrente voltaggio-dipendente con una V1/2 di 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C e D). Questi risultati indicano che la tensione-modulazione è intatta in TRPV3-H426N e TRPV3-R696K, e implica che la perdita di tensione-dipendenza è improbabile che sia la causa della diminuzione delle risposte a 2-APB in questi canali mutanti.

Sensibilità alla temperatura di TRPV3-H426N e TRPV3-R696K.

La sensibilità alla temperatura è una caratteristica della funzione del canale TRPV3 (14, 16, 23). Pertanto, abbiamo chiesto se l’attivazione della temperatura era alterata in TRPV3-H426N e TRPV3-R696K cloni. Abbiamo misurato la temperatura (25 a 42 ° C) l’attivazione di cellule HEK293 trasfettate con wild-type TRPV3, TRPV3-H426N, o TRPV3-R696K mutante in un saggio FLIPR. Risposte al calore di TRPV3-H426N erano uguali o leggermente più grande di wild-type TRPV3 risposte (n = 4 esperimenti), suggerendo che 2-APB- e calore-attivazione possono essere separati (Fig. S2E; e dati non mostrati). Tuttavia, le risposte di calore in TRPV3-R696K erano molto più piccoli rispetto al tipo selvatico (n = 3 esperimenti), suggerendo che questo mutante non è specificamente alterare l’attivazione 2-APB (Fig. S2E).

Calcium-Dependent desensibilizzazione di TRPV3-R696K.

Una caratteristica interessante della risposta 2-APB in TRPV3-R696K-transfected cellule HEK293 è desensibilizzazione veloce a >30 μM 2-APB e un off-risposta a 2-APB ad alte concentrazioni (Fig. S3). Questo fenomeno è in contrasto con il tipo selvaggio TRPV3, che sensibilizza in risposta alla stimolazione ripetitiva/continua di sostanze chimiche o calore (14, 16). Il meccanismo alla base della sensibilizzazione TRPV3 è proposto per essere una perdita di inibizione del calcio di questo canale (22). Poiché la desensibilizzazione della maggior parte degli altri canali TRP (come TRPV1 e TRPA1) a stimoli chimici o di temperatura dipende anche dal calcio extracellulare (24, 25), abbiamo deciso di verificare se il calcio extracellulare ha un ruolo nelle risposte desensibilizzanti provocate da 2-APB in TRVP3-R696K. Sorprendentemente, in assenza di calcio extracellulare, 100 μM 2-APB attivato un robusto, wild-type-come correnti in entrata e in uscita in TRPV3-R696K (densità di corrente di TRPV3-R696K: 755.7 ± 200.0 pA/pF a +100 mV, -641.2 ± 133.9 pA/pF a -100 mV (n = 5); wild-type TRPV3: 615.0 ± 266.7 pA/pF a +100 mV, e -471.0 ± 83.2 pA/pF a -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A e B). Questo risultato suggerisce che la sostituzione di un arginina da una lisina in posizione 696 nella casella TRP di TRPV3 guida il canale in uno stato desensibilizzante su 2-APB ma non canfora stimolazione in un modo calcio-dipendente. Un residuo putativo di legame al Ca2+ nel dominio dell’ansa del poro, l’aspartato 641, è conservato tra tutti i canali TRPV ed è fondamentale per le proprietà di permeazione dei canali TRP (26, 27). La mutazione di D641 in asparagina (N) ha dimostrato di ridurre il blocco del rosso rutenio e l’inibizione del calcio extracelullare ad alta affinità di TRPV3 e altri canali TRP (17, 22, 26, 27). Pertanto, abbiamo esaminato se la mutazione D641N potrebbe alleviare il clone TRPV3-R696K dalla perdita calcio-dipendente della risposta 2-APB. In un saggio FLIPR, il TRPV3-D641N aveva un EC50 di 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), che è circa la metà del valore di wild-type TRPV3 (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Il doppio mutante TRVP3-D641N/R696K aveva un EC50 di 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), dimostrando che la mutazione D641N ha completamente ripristinato la risposta 2-APB del TRPV3-R696K. Come previsto, la risposta canfora era simile tra TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N, e TRPV3-D641N/R696K (Fig. S4 C e D). Questi studi dimostrano che TRPV3-R696 non è puramente una mutazione 2-APB. I deficit osservati sono mediati dal calcio, colpendo le risposte 2-APB ma non canfora.

La sensibilità 2-APB in TRPV3 Orthologs.

Le conservazioni di aminoacidi e le variazioni tra gli ortologi sono strumenti utili per sezionare le relazioni struttura-funzione delle proteine, compresi i canali TRP (28, 29). Pertanto, abbiamo chiesto se questi ortologhi TRPV3 hanno risposte comparabili canfora e 2-APB. Infatti, umano, cane e rana TRPV3 canali, che hanno istidine al topo-equivalente posizione 426 (Fig. 2A), hanno simili risposte 2-APB quando sovraespresso in cellule HEK293 (anche se le risposte canfora in Xenopus tropicalis TRPV3 erano diminuiti rispetto al topo wild-type TRPV3) (Fig. 2C). Come previsto, quando H426 in umano, cane e rana è stato mutato in N, 2-APB concentrazione-risposta curve sono state fortemente spostate a destra in ciascuno di questi TRPV3 ortologhi (Fig. 2B). Ancora una volta, questa mutazione non ha diminuito la sensibilità alla canfora rispetto agli ortologhi TRPV3 wild-type (Fig. 2C). Al contrario, entrambi i mutanti TRPV3 umani e di rana H426N avevano una sensibilità alla canfora leggermente superiore alle loro controparti wild-type. Questi risultati indicano che il meccanismo di attivazione 2-APB di TRPV3 potrebbe essere conservato in diverse specie.

Interessante, anche se R696 è conservato nella casella TRP di TRPV3 tra tutte le specie, la posizione equivalente al mouse 426 in TRPV3 pollo (cTRPV3) è un N (427). Come mostrato sopra, una sostituzione H-N al residuo 426 in specie di mammiferi o anfibi interferisce con adeguate risposte 2-APB (Fig. 2A). Coerente con questo residuo di essere importante per le risposte 2-APB, la EC50 di 2-APB in cTRPV3 è 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) rispetto a quella di 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) per TRPV3 mouse. Sorprendentemente, mutando N427 in H spostato la curva di concentrazione-risposta di 2-APB significativamente a sinistra (EC50 di 6.1 ± 0.9 μM, nHill = 2.3), mentre lasciando il valore EC50 per canfora invariato (Fig. 3A). Intere cellule registrazione patch clamp confermato che la concentrazione 2-APB curva di risposta è stata fortemente spostata a sinistra nel pollo TRPV3-N427H rispetto al wild-type cTRPV3 sia a +100 e -100 mV (Fig. 3B). Singole registrazioni del canale ha rivelato quasi 200 volte l’aumento delle aperture del canale rispetto al livello basale da 25 μM 2-APB in patch inside-out da cTRPV3-N427H-esprimendo le cellule (n = 7), mentre non sono stati osservati cambiamenti significativi in patch inside-out da wild-type cTRPV3-esprimendo le cellule HEK293 (n = 5). Tuttavia, 6 mM canfora fortemente aumentato singolo canale aperture in inside-out patch da HEK293 cellule trasfettate con cTRPV3 wild-type o cTRPV3-N427H mutante a livelli simili (Fig. 3 C-E). Quindi, un singolo punto-mutazione in pollo TRPV3 aumenta specificamente la sua sensibilità al 2-APB.

La sensibilità 2-APB in ThermoTRPs correlati: TRPV1, TRPV2, e TRPV4.

Il TRPV3 mammifero è strettamente legato al TRPV1 (39% di omologia aminoacidica), TRPV2 (36% di omologia), e TRPV4 (38% di omologia). È interessante notare che il 2-APB è un agonista comune di TRPV1, TRPV2 e TRPV3, ma non di TRPV4 (18). Pertanto, abbiamo chiesto se esiste un meccanismo comune per l’azione 2-APB su questi canali ionici correlati. La posizione equivalente del topo TRPV3 His-426 è N in TRPV1 (N419), TRPV2 (N379), e TRPV4 (N456) (Fig. 4A; Fig. S5A). La posizione equivalente del topo TRPV3 R696 nel TRP box è anche R (R701) in TRPV1, una lisina conservata (K664) in TRPV2, e un triptofano non carico (W737) in TRPV4 (Fig. 4A; Fig. S5A).

Ci siamo concentrati sul residuo N-terminale H, che è specificamente richiesto per adeguate risposte 2-APB per mammiferi e anfibi TRPV3, e una mutazione N-H a questo residuo è sufficiente per indurre robuste risposte 2-APB in TRPV3 pollo. I wild-type TRPV1 e TRPV2 portano Ns nella posizione equivalente di TRPV3 H426, ma mostrano risposte robuste a 2-APB. Questo risultato solleva la possibilità che TRPV1 e TRPV2 rispondano a 2-APB attraverso meccanismi distinti rispetto a TRPV3. Tuttavia, abbiamo testato se l’introduzione di una H in questa posizione colpisce specificamente le risposte 2-APB in TRPV2 e TRPV1. Il mutante TRPV1-N419H ha avuto risposte migliorate sia al 2-APB che alla capsaicina, indicando un effetto aspecifico sull’espressione o sulla funzione del canale (Fig. S5B). Il corrispondente mutante TRPV2-N379H aveva simili risposte 2-APB e probenecid (un altro agonista TRPV2) rispetto al wild-type TRPV2 (Fig. S5C) (30). Questi risultati suggeriscono che il meccanismo di attivazione 2-APB di TRPV2 e TRPV1 non è completamente conservato con quello di TRPV3 (vedi discussione).

Abbiamo poi chiesto se i residui equivalenti di TRPV3-H426 e R696 sono responsabili della mancanza di risposte 2-APB in TRPV4. Per rispondere a questa domanda, abbiamo mutato i residui di aminoacidi equivalenti a N456 e W737 in TRPV4 in H e R, rispettivamente (Fig. 4A). Wild-type TRPV4 e TRPV4-W737R hanno mostrato solo marginali risposte 2-APB rispetto ai controlli trasfettati dal vettore (Fig. 4B). Tuttavia, notevolmente, le cellule HEK293 trasfettate con TRPV4-N456H ha risposto a 2-APB con un EC50 di 131.0 ± 3.3 μM (nHill = 2.4). Inoltre, TRPV4 che trasportano le doppie mutazioni N456H/W737R ha mostrato risposte ancora più robuste a 2-APB, con un EC50 di 10.0 ± 0.8 μM (nHill = 1.2) (vicino al valore del topo wild-type TRPV3) (Fig. 4B). Le risposte all’agonista TRPV4 4-α-PDD non erano significativamente diverse tra TRPV4 wild-type e tutti i mutanti TRPV4, suggerendo che l’aumento delle risposte 2-APB non sono dovute ad un aumento del livello di espressione TRPV4 o guadagno complessivo della funzione (Fig. 4B). Registrazioni in escissi dentro-fuori patch che esprimono TRPV4, TRPV4-N456H, TRPV4-W737R, o TRPV4-N456H/W737R rivelato singolo canale attività da 150 μM 2-APB in entrambi TRPV4-N456H e TRPV4-N456H/W737R, con quest’ultimo mostra risposte più robuste (Fig. S6 B e C). Nessun 2-APB-attivato attività del canale singolo è stato visto in wild-type TRPV4 e TRPV4-W737R (Fig. S6A; e dati non mostrati). Questi risultati indicano che le differenze ai 2 residui aminoacidici identificati nel nostro schermo sono responsabili della mancanza di sensibilità 2-APB di TRPV4.

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