Efficiente produzione di acido 3-idrossipropionico da glicerolo da Klebsiella pneumoniae ingegnerizzato metabolicamente

Nella produzione di 1,3-propandiolo o 3-HP da glicerolo, l’acido lattico è il principale sottoprodotto che riduce notevolmente la resa del prodotto. Pertanto, sono stati fatti tentativi per ridurre la produzione di lattato mediante delezione del gene che codifica la lattato deidrogenasi (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Poiché entrambe le reazioni che formano 1,3-propandiolo e 3-HP competono per il loro substrato comune 3-idrossialdeide (3-HPA), la delezione della propandiolo ossidoreduttasi favorisce la produzione di 3-HP (Ashok et al. 2011). Pertanto, in questo studio, i geni ldhA e dhaT sono stati eliminati per migliorare la produzione di 3-HP.

Effetto della carenza di ldhA sulla produzione di 3-HP

Il ceppo carente di ldhA JJQ01 è stato costruito e l’eliminazione di ldhA è stata confermata come mostrato nella Figura S2A. I ceppi ricombinanti Kp4 (pUC18-kan-aldH) e JJQ01 (pUC18-kan-aldH) sono stati costruiti e le fermentazioni fed-batch sono state effettuate nel bioreattore da 5 litri. I profili di crescita cellulare, consumo di glicerolo e produzione di metaboliti sono mostrati in Fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) ha prodotto 18.3 g/L di 3-HP con una resa di 0.21 mol/mol in 38 h, mentre l’acido lattico ha raggiunto 32.2 g/L con una resa più alta di 0.34 mol/mol. Inoltre, sono stati prodotti 17,6 g/L di 2,3-butandiolo, 6,1 g/L di 1,3-propandiolo e 10,7 g/L di acido acetico. La formazione di lattato aumenta non solo il costo, ma anche la difficoltà di recuperare il 3-HP, che è un isomero del lattato. Inoltre, il lattato è un inibitore principale della biosintesi di 3-HP e 1,3-propandiolo (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). La carenza di ldhA ha efficacemente eliminato la formazione di lattato e la produzione di 3-HP ha raggiunto 48,3 g/L con una resa di 0,28 mol/mol, come mostrato in Fig. 2b. La concentrazione e la resa di 3-HP in questo ceppo carente di ldhA sono stati aumentati di 1,64 volte e 33,3%, rispettivamente, rispetto al ceppo Kp4 (pUC18-kan-aldH). Eccetto la piccola quantità di formazione di etanolo (circa 4 g/L), l’accumulo di piruvato e formiato da parte del ceppo mutante ldhA non è stato rilevato, che non sono stati quasi osservati nel caso di utilizzo del ceppo wild-type.

Questi risultati indicano chiaramente che il blocco della produzione di acido lattico ha notevolmente reindirizzato il flusso di carbonio alla produzione di 3-HP. L’assimilazione del glicerolo attraverso DhaB era significativamente migliorata, quasi 0,4 mol/mol di glicerolo era diretto attraverso DhaB a 3-HPA, che era coerente con altri studi (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). La riduzione del lattato potrebbe abbassare la tossicità per le cellule, favorire la crescita cellulare e la produttività di 3-HP. Tuttavia, la riduzione del lattato ha anche aumentato la formazione di 2,3-butandiolo e 1,3-propandiolo, che ha raggiunto 21,9 g/L con un rendimento di 0,13 mol/mol e 18,5 g/L con un rendimento di 0,12 mol/mol, rispettivamente. A causa della delezione di ldhA, l’eccesso di NADH derivato dall’aumento dell’accumulo di 3-HP potrebbe promuovere la produzione di 2,3-butandiolo e 1,3-propanediolo invece del lattato per rigenerare NAD+ e mantenere l’equilibrio redox. Infatti, la formazione di etanolo ha anche sostenuto la rigenerazione di NAD+, che ha provocato un flusso maggiore dal piruvato all’etanolo rispetto al flusso al piruvato.

Effetto della carenza di dhaT sulla produzione di 3-HP

La delezione di ldhA ha aumentato drasticamente la produzione di 3-HP, allo stesso tempo, anche la produzione di 1,3-propanediolo è stata aumentata a 18,5 g/L. Ko et al. (2017) hanno riportato che 43 g/L di 3-HP e 21 g/L di 1,3-propandiolo sono stati ottenuti riducendo l’acetato e altri sottoprodotti. Sebbene la formazione di 1,3-propandiolo favorisca l’utilizzo del glicerolo rigenerando il cofattore, esso rappresenta una parte sostanziale del flusso di carbonio del glicerolo. Poiché 1,3-propandiolo e 3-HP competono per lo stesso precursore 3-HPA, per limitare il flusso a 1,3-propandiolo, è stato costruito il ceppo ldhA e dhaT double-knockout (mostrato nel file aggiuntivo 1: Figura S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH). I risultati della fermentazione fed-batch nel reattore 5-L sono mostrati in Fig. 2c. Inaspettatamente, concomitante ldhA e dhaT knockout solo portato a 44,5 g / L di 3-HP, anche se il rendimento è stato aumentato a 0,32 mol / mol glicerolo. La delezione di dhaT ha portato ad una riduzione del titolo di 1,3-propandiolo e del rendimento a 9,9 g/L e 0,07 mol/mol, rispettivamente. Ma l’1,3-propandiolo era ancora prodotto nella reazione catalizzata da YqhD e da altre ossidoreduttasi (Ashok et al. 2013). Inoltre, rispetto a JJQ01(pUC18-kan-aldH), la produzione di 2,3-butandiolo è stata leggermente aumentata da 21,9 a 23,4 g/L, indicando che il flusso verso la via del 2,3-butandiolo è stato aumentato per consumare il NADH in eccesso derivato dalla reazione catalizzata da ALDH. La sintesi dell’1,3-propandiolo gioca un ruolo chiave nella regolazione dell’equilibrio redox in K. pneumoniae. All’interno della via di ossidazione, la formazione di una molecola di acetato dal glicerolo produce tre molecole di NADH, allo stesso tempo si forma una molecola di ATP. Di conseguenza, la delezione sia di ldhA che di dhaT ha ridotto notevolmente la capacità di rigenerazione di NAD+, e più NADH è stato ossidato attraverso la formazione di 2,3-butandiolo, con conseguente aumento del 2,3-butandiolo. La riduzione del tasso di aerazione (limitando l’apporto di ossigeno) potrebbe aumentare la produzione di acetato per fornire più ATP, ma allo stesso tempo si è formato più NADH, con conseguente ulteriore aumento della produzione di 2,3-butandiolo. Tuttavia, il NAD+ rigenerato sembrava essere inferiore a quello formato nella reazione catalizzata da DhaT, portando a una minore produzione di 3-HP. Pertanto, la fornitura di una quantità adeguata di ossigeno per generare NAD+ senza influenzare l’attività di DhaB e la dissimilazione del glicerolo è fondamentale per la produzione di 3-HP nella fermentazione microaerobica.

In questo studio, non è riuscito a migliorare il 3-HP eliminando il gene dhaT. La dissimilazione del glicerolo è regolata da glicerolo deidrogenasi DhaD, glicerolo chinasi GlpK, glicerolo deidratasi DhaB e 1,3-propandiolo ossidoreduttasi 1,3-PDOR. La rigidità del punto di diramazione del glicerolo implica che il miglioramento della produzione di 3-HP mediante la delezione di geni coinvolti nella ripartizione del flusso di glicerolo è difficile. Ashok et al. (2011) hanno determinato le attività intrinseche di DhaD, DhaB, ALDH e 1,3-PDORs dopo la cancellazione del gene dhaT. Hanno trovato che l’attività di DhaD era leggermente migliorata, l’attività di ALDH leggermente diminuita, e l’attività di DhaB significativamente diminuita. Zhang et al. (2008) hanno anche analizzato la robustezza nei punti di diramazione della via di dissimilazione del glicerolo. È stato dimostrato che il partizionamento del flusso di carbonio tra il ramo riduttivo e quello ossidativo era robusto rispetto alle condizioni ambientali.

Effetto dell’aerazione sulla produzione di 3-HP

I nostri studi precedenti hanno mostrato che la condizione microaerobica era favorevole alla produzione di 3-HP. Rispetto al processo anaerobico, nella fermentazione microaerobica la produzione di 3-HP era significativamente aumentata a causa del più alto livello di espressione dell’aldeide deidrogenasi, e allo stesso tempo, la produzione di 1,3-propandiolo era ridotta (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) hanno riportato che l’attività specifica della glicerolo deidratasi in K. pneumoniae a un tasso di aerazione di 0,04 vvm era superiore del 59% rispetto a quella in assenza di aria. Ma, è stato riportato che la glicerolo deidratasi può essere rapidamente inattivata dall’ossigeno (Toraya 2000; Ruch e Lin 1975), e ha influenzato significativamente la produzione di 3-HP (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Inoltre, il coenzima B12, il cofattore per DhaB, non è sufficientemente sintetizzato in condizioni di alta aerazione nella maggior parte dei produttori naturali di 3-HPA come K. pneumoniae. Huang et al. (2013) e Ko et al. (2017) hanno anche dimostrato che le condizioni altamente aerobiche non erano vantaggiose per la produzione di 3-HP. Pertanto, abbiamo intrapreso preliminare fed-batch esperimenti in diverse condizioni di aerazione e anche trovato che il mantenimento di un alto tasso di aerazione era sfavorevole per la produzione di 3-HP dopo la crescita delle cellule cessato (dati non mostrati). Nella cultura fed-batch di JJQ02(pUC18-kan-aldH), abbiamo adottato un tasso di aerazione metà del tasso iniziale quando la OD650 era chiusa al valore massimo. I profili di crescita, glicerolo e metaboliti sono mostrati in Fig. 3, e la freccia nera ha indicato il punto in cui abbassare il tasso di aerazione (0,5 vvm).

Il titolo finale di 3-HP ha raggiunto 61.9 g/L con una resa di 0,58 mol/mol nel reattore da 5 L in 38 ore. La concentrazione di 3-HP e la resa di JJQ02 (pUC18-kan-aldH) erano 3,3 e 2,76 volte quelle di Kp4 (pUC18-kan-aldH), e 1,28 e 2,07 volte quelle di JJQ01 (pUC18-kan-aldH). I risultati hanno mostrato che la produzione sia di 1,3-propandiolo che di 2,3-butandiolo si è fermata a 20 ore. Tuttavia, il titolo di 3-HP ha continuato ad aumentare anche se il tasso di produzione è diminuito da questo punto temporale. Nella parte successiva della fermentazione microaerobica, anche se poco NADH è stato rigenerato attraverso la formazione di 1,3-propandiolo e 2,3-butandiolo, un po’ di NADH potrebbe ancora essere rigenerato attraverso la catena di trasporto degli elettroni, perché il modo più efficiente per rigenerare NAD+ è attraverso la catena di trasporto degli elettroni in presenza di ossigeno (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), con conseguente aumento di 3-HP senza ovvio aumento di 1,3-propandiolo e 2,3-butandiolo.

Fermentazione in scala di 300-L

Per esaminare la fattibilità del ceppo JJQ02(pUC18-kan-aldH) per la produzione di 3-HP in un bioreattore più grande, la fermentazione fed-batch è stata effettuata in un bioreattore da 300-L seguendo le condizioni di fermentazione stabilite nel fermentatore da 5-L. La strategia di aerazione a due stadi è stata adottata; il tasso di aerazione è stato abbassato alla metà nel punto di tempo della freccia nera come mostrato in Fig. 4. 3-HP raggiunto 54,5 g/L con un rendimento di 0,43 mol/mol, e la concentrazione e il rendimento erano 12,2 g/L e 0,11 mol/mol per 1,3-propandiolo, 21,3 g/L e 0.17 mol/mol per il 2,3-butandiolo, e 9,3 g/L e 0,11 mol/mol per l’acetato in 51 h (Fig. 4).

Rispetto ai risultati ottenuti nel reattore da 5 L, il titolo e la resa molare del 2,3-butandiolo nel reattore da 300 L erano ovviamente aumentati, che erano simili a quelli con lo stesso sforzo nel reattore da 5 L ad un tasso di aerazione costante di 1 vvm. Ciò implica che il trasferimento di ossigeno nel reattore da 300 L potrebbe essere un po’ più alto di quello nel reattore da 5 L con tasso di aerazione ridotto, perché alcune ricerche hanno indicato che la produzione di 2,3-butandiolo richiede un tasso di aerazione adeguato (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Sotto la condizione di aerazione nel reattore da 300 L, l’espressione degli enzimi legati alla formazione di 2,3-butandiolo e il pool di NADH o il rapporto NADH/NAD+ hanno promosso la produzione di 2,3-butandiolo, e l’espressione di DhaB e AldH potrebbe essere leggermente influenzata.

In un’ottica di equilibrio redox, nel ceppo ldhA dhaT double-mutant, il NADH formato nella reazione catalizzata da ALDH era in parte rigenerato attraverso la formazione di 2,3-butandiolo e altri metaboliti ridotti come etanolo e succinato, e in parte dalla catena di trasporto degli elettroni (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Pertanto, il tasso di aerazione nella fermentazione con microaerazione ha influenzato significativamente i prodotti finali. Nella fermentazione nel reattore da 300 L, anche se il tasso di aerazione è stato ridotto alla metà di quello iniziale, la situazione di trasferimento dell’ossigeno potrebbe ancora differire notevolmente da quella nel reattore da 5 L a causa delle diverse caratteristiche di trasferimento dell’ossigeno, che era un argomento tradizionale nello scale-up dei bioprocessi. Le differenze nella distribuzione dei prodotti nei diversi reattori indicavano l’importanza di un controllo preciso della fornitura di ossigeno, mentre solo la riduzione del tasso di aerazione sembrava troppo approssimativa. Tuttavia, anche se il titolo di 3-HP e la resa erano leggermente diversi da quelli del reattore da 5 L, lo scale-up ha avuto successo. Poiché le prestazioni del trasferimento di ossigeno nel reattore da 300 L erano diverse da quelle del reattore da 5 L, ci si aspettava che un’ulteriore regolazione precisa del tasso di aerazione nel reattore da 300 L potesse migliorare il livello di 3-HP.