The potential use of induced pluripotent stem cells (iPSCs) in personalized regenerative medicine applications may be augmented by transgenics, inclusa l’espressione di etichette cellulari costitutive, reporter di differenziazione o modulatori di fenotipi di malattie. Quindi, c’è un precedente per l’espressione riproducibile del transgene tra i sottocloni iPSC con background genetici isogenici o diversi. Utilizzando virus o vettori trasposoni, i siti di integrazione del transgene e il numero di copie sono difficili da controllare e quasi impossibili da riprodurre su più linee cellulari. Inoltre, i transgeni integrati in modo casuale sono spesso soggetti a effetti di posizione pleiotropici come conseguenza dei cambiamenti epigenetici inerenti alla differenziazione, minando le applicazioni in iPSCs. Per affrontare questo problema, abbiamo adattato le popolari tecnologie nucleasi TALEN e CRISPR/Cas9 per introdurre transgeni in loci predefiniti e superare gli effetti di posizione casuali. AAVS1 è un locus esemplare all’interno del gene PPP1R12C che permette una robusta espressione di transgeni guidati dal promotore CAG. Il targeting del gene controlla il numero di copie del transgene in modo che i modelli di espressione del reporter siano riproducibili e scalabili di ∼2 volte. Inoltre, l’espressione genica è mantenuta durante la cultura iPSC umana a lungo termine e la differenziazione in vitro lungo più lineage. Qui, delineiamo il nostro protocollo di targeting AAVS1 utilizzando vettori donatori standardizzati e metodi di costruzione, oltre a fornire considerazioni pratiche per la cultura iPSC, selezione di farmaci e genotipizzazione.