Espressione genica dei trasportatori di colesterolo ABCA1 e ABCG1 nelle cellule mononucleate del sangue periferico in pazienti con sindrome metabolica

Abstract

I geni ABCA1 e ABCG1 codificano le proteine di trasporto del colesterolo che svolgono un ruolo chiave nell’omeostasi del colesterolo e dei fosfolipidi. Questo studio aveva lo scopo di valutare e confrontare l’espressione dei geni ABCA1 e ABCG1 in pazienti con sindrome metabolica e in individui sani. Questo studio caso-controllo è stato eseguito su 36 pazienti con sindrome metabolica e lo stesso numero di individui sani a Hamadan (ovest dell’Iran) durante il 2013-2014. L’RNA totale è stato estratto dalle cellule mononucleari e purificato utilizzando la colonna RNeasy Mini Kit. L’espressione dei geni ABCA1 e ABCG1 è stata eseguita mediante qRT-PCR. Il profilo lipidico e la glicemia a digiuno sono stati misurati con procedure colorimetriche. L’espressione di ABCG1 nei pazienti con sindrome metabolica era significativamente più bassa (circa il 75%) rispetto a quella del gruppo di controllo, mentre per l’espressione di ABCA1, non c’era alcuna differenza significativa tra i due gruppi studiati. Il confronto di altri parametri come HDL-C, FBS, BMI, circonferenza vita e pressione sanguigna sistolica e diastolica tra i pazienti con sindrome metabolica e gli individui sani ha mostrato differenze significative (). La diminuzione dell’espressione di ABCG1 nei pazienti con sindrome metabolica rispetto agli individui sani suggerisce che l’iperglicemia, i metaboliti correlati e l’iperlipidemia oltre la capacità del trasportatore hanno determinato una diminuzione dell’espressione di ABCG1. L’assenza di un cambiamento significativo nell’espressione del gene ABCA1 tra due gruppi può indicare un diverso meccanismo di regolazione per l’espressione di ABCA1.

1. Introduzione

La sindrome metabolica (MetS) è definita come un insieme di fattori di rischio correlati di diabete e malattie cardiovascolari (CVD). Ci sono alcuni criteri per la diagnosi clinica della sindrome metabolica che includono un’elevata circonferenza della vita (≥102 cm negli uomini e ≥88 cm nelle donne), trigliceridi elevati (≥150 mg/dL o 1.7 mmol/L), riduzione del colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL-C <40 mg/dL o 1,03 mmol/L negli uomini e <50 mg/dL o 1,3 mmol/L nelle donne), e pressione sanguigna elevata (≥130 mm Hg di pressione sistolica o ≥85 mmHg di pressione diastolica). La MetS può essere diagnosticata dall’osservazione di tre di questi criteri. Negli ultimi anni, la prevalenza della MetS è aumentata in tutto il mondo; tuttavia, negli Stati Uniti d’America, è diminuita dal 25,5% nel 1999/2000 al 22,9% nel 2009/2010 . Weiss e colleghi hanno riferito che l’obesità è direttamente associata ad una maggiore prevalenza di MetS. C’è un’associazione inversa tra il CVD e il livello di HDL-C nel plasma, uno dei criteri della sindrome metabolica. La lipoproteina ad alta densità, una sottofrazione delle lipoproteine circolanti, svolge un ruolo importante nel trasporto del colesterolo dal tessuto periferico alle cellule epatiche. L’HDL è ricca di proteine Apo A-I e Apo A-II, e più di due terzi del suo contenuto è Apo A-I.

I trasportatori transmembrana ABC hanno un ruolo importante nell’assorbimento del colesterolo dal macrofago all’HDL e diminuiscono la formazione di cellule di schiuma. ABCA1 composto da 2261 aminoacidi è presente nella maggior parte dei tessuti. Negli ultimi anni, è stato dimostrato che ABCA1 svolge un ruolo essenziale nella protezione dalle malattie cardiovascolari. La sintesi di HDL dipende direttamente dall’attività di ABCA1 nelle cellule epatiche; in altre parole, ha una funzione chiave nella protezione delle cellule arteriose contro le cellule di schiuma attraverso l’aumento delle HDL del plasma. L’attività dei macrofagi arteriosi ABCA1 ha mostrato un’associazione inversa con la formazione di cellule di schiuma, in quanto con l’aumento della sua attività la formazione di cellule di schiuma si riduce .

L’attività ridotta o compromessa ABCA1 potrebbe causare alcune malattie come il diabete di tipo 2, la malattia di Tangeri, e CVD prematuro .

Il gene ABCG1 si trova sul cromosoma 21q22.3 . Sia ABCA1 che ABCG1 portano alla riduzione del colesterolo dei tessuti attraverso il suo efflusso verso HDL, ma ABCG1 trasporta il colesterolo dei tessuti verso HDL2 e HDL3 e ABCA1 lo trasporta verso Apo A-I senza lipidi. I macrofagi sono il tessuto più importante di ABCA1 e ABCG1 azione. In molti studi, gli effetti di upregulation e downregulation di questi geni sono stati esaminati.

L’efflusso ridotto del colesterolo è la conseguenza della mancanza di espressione di ABCA1 in vitro; può portare ad un aumento dell’aterosclerosi, ma l’upregulation di ABCA1 risulta nella riduzione dell’aterosclerosi. La downregolazione di ABCG1 ha anche gli stessi effetti sull’efflusso del colesterolo, ma ci sono risultati controversi circa l’impatto della downregolazione di ABCG1 sull’aterosclerosi.

In MetS, i modelli di espressione di alcuni geni cambiano e possono portare a obesità, diabete e ipertensione. Nel presente studio, abbiamo mirato a valutare l’espressione dei geni ABCA1 e ABCG1 in pazienti con MetS, poiché questi geni sono coinvolti nella sintesi dei trasportatori che hanno un ruolo cruciale nel trasporto del colesterolo.

2. Materiali e metodi

2.1. Soggetti

Questo studio caso-controllo è stato condotto su pazienti che si sono rivolti a un reparto di endocrinologia in un ospedale di Hamadan (ovest dell’Iran) nel 2013-2014. Sono stati selezionati trentasei pazienti con sindrome metabolica. Inoltre, 36 individui sani di pari età e sesso sono stati selezionati come gruppo di controllo. Nessuno degli individui sani aveva i criteri della sindrome metabolica.

Il criterio di inclusione nel gruppo della sindrome metabolica era avere tre su cinque delle caratteristiche di cui sopra. I pazienti con una storia di consumo di farmaci antilipidici, contraccettivi e diuretici sono stati esclusi dallo studio. Sono stati esclusi anche i pazienti in gravidanza e i pazienti con diabete, infiammazione e infezione.

2.2. Campionamento del sangue

Un campione di sangue di 2,5 mL di ogni soggetto è stato aggiunto ad una provetta contenente EDTA ed è stato tenuto a 4°C per l’estrazione dell’RNA (non più di due ore dopo).

2.3. Estrazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

Per l’isolamento delle PBMC sono state utilizzate le soluzioni Lymphodex (Germania) e Henx (Iran). Circa 2 mL di soluzione Henx sono stati aggiunti a un volume uguale di sangue e mescolati completamente; poi sono stati versati su 3 mL di soluzione Lymphodex con attenzione e lentamente. Successivamente, la miscela è stata posta su Lymphodex ed è stata centrifugata a 1000 g per 20 minuti. Lo strato bianco intermedio tra il plasma e il Lymphodex è stato isolato come cellule mononucleate (MCs); poi il tampone Henx è stato aggiunto su MC, mescolato completamente, e centrifugato. Infine, il surnatante è stato scartato e il processo è stato ripetuto ancora una volta.

2.4. Estrazione dell’RNA e sintesi del cDNA

L’estrazione netta dell’RNA è stata eseguita utilizzando il kit Gene JET RNA Purification secondo il protocollo del produttore. La qualità e la quantità dell’RNA purificato sono state analizzate usando il NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA); poi l’integrità di ogni campione di RNA è stata esaminata usando un gel di agarosio all’1%, 1x TBE.

L’RNA è stato convertito in cDNA utilizzando RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) seguendo il protocollo: passo 1: annealing del primer a 25°C per 5 min; passo 2: sintesi del cDNA a 42°C per 60 min; passo 3: inattivazione termica a 70°C per 5 min. I prodotti sono stati conservati a -80°C per le fasi successive.

2.5. Progettazione dei primer

I primer specifici per ogni gene sono stati progettati dal software Allele ID (versione 7.6). Al fine di aumentare la specificità della reazione di PCR in tempo reale e ridurre i risultati falsi positivi, uno di ogni coppia di primer è stato progettato per essere attaccato alla zona di giunzione esone-esone. I criteri accurati dei primer utilizzati per ogni gene sono presentati nella tabella 1. Il gene housekeeping 18S rRNA è stato usato come controllo interno.

L’espressione relativa dei geni è stata calcolata misurando il valore di soglia del ciclo (CT) per ogni campione utilizzando il termociclatore C1000 e il sistema in tempo reale CFX96 (Bio-Rad, USA) e SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa No. RR820L). La media del CT in triplicato di ogni campione è stata determinata come valore CT. Le quantità di ingredienti della reazione qRT-PCR comprendevano 10 μL di SYBR green, 7 μL di acqua deionizzata e 1 μL di ciascuno dei primer forward, reverse primer e template. La qRT-PCR è stata eseguita in queste condizioni: attivazione iniziale a 95°C per 30 sec e poi 40 cicli dei seguenti passaggi ripetuti: denaturazione a 95°C per 5 sec, annealing alla temperatura di annealing ottimizzata per la durata adeguata di ogni gene, ed estensione a 72°C per 30 sec, e alla fine, i dati sono stati acquisiti aumentando la temperatura da 72°C a 95°C per 0.5°C/0.05 sec. Poi, i prodotti di PCR sono stati elettroforesi (su gel di agarosio 1%, 1x TBE) per verificare la specificità degli ampliconi.

2.6. Valutazione dei fattori biochimici del siero

Un campione di sangue di due millilitri è stato raccolto da ogni soggetto e centrifugato a 3000 rpm per 10 min per la separazione del siero. Colesterolo totale (TC), LDL-C, TG, FBS e HDL-C sono stati esaminati utilizzando il kit Pars Azmun (Iran) di Hitachi 911 (Germania).

2.7. Analisi e interpretazione dei risultati

formula è stata utilizzata per l’analisi dell’espressione genica relativa della sindrome metabolica e dei gruppi di controllo. L’efficienza della PCR in tempo reale è stata calcolata per ogni gene utilizzando la diluizione 10-2; successivamente, il numero ottenuto è stato posto alla seguente formula di calcolo per misurare i cambiamenti delle pieghe dell’espressione genica :Il software SPSS V.16 è stato utilizzato per l’analisi statistica con intervalli di confidenza del 95%. La distribuzione normale delle variabili è stata controllata con il metodo Kolmogorov-Smirnov e poi i valori sono stati confrontati tra due gruppi tramite il test dei campioni indipendenti.

3. Risultato

Le caratteristiche demografiche e i fattori biochimici dei gruppi studiati sono presentati nella tabella 2. Il rapporto maschio/femmina era 1/3 in ogni gruppo (12 M e 24 F). Come mostrato nella tabella 2, le differenze in tutti i parametri esaminati erano statisticamente significative tra i due gruppi () ad eccezione dell’età e delle LDL-C. Il gruppo della sindrome metabolica aveva BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, pressione sanguigna diastolica/diastolica e circonferenza vita più alti rispetto agli individui sani, mentre HDL-C era significativamente più basso nella sindrome metabolica.

3.1. Risultati della qRT-PCR

Dopo il completamento della reazione PCR, i risultati sono stati verificati tramite l’analisi della curva di reazione, la curva di fusione dei prodotti e l’elettroforesi dei prodotti PCR. L’elettroforesi è stata eseguita su agarosio all’1% utilizzando una scala di DNA da 100 bp. I risultati sono mostrati nella Figura 1.

Figura 1

Elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti RT-PCR: corsia 1, prodotti ABCG1 con 135 bp; corsia 2, prodotto 18S RNA con 151 bp; corsia 3, standard di peso molecolare con 100-1000 bp; corsia 4, controllo negativo con <100 bp; corsia 5, prodotti ABCA1 con 180 bp.

3.2. Valutazione dell’espressione genica nelle PBMC

I livelli di espressione dei geni sono stati misurati nelle cellule mononucleate del sangue periferico e confrontati tra due gruppi tramite il calcolo del ΔCT per ogni gene. Non c’era differenza nell’espressione di ABCA1 tra due gruppi, ma l’espressione di ABCG1 era significativamente più bassa nel gruppo MetS. I risultati dettagliati sono mostrati nella tabella 3.

Inoltre, il calcolo del cambiamento di fold in espressione ABCG1 () ha indicato 3.1-fold espressione inferiore nel gruppo MetS.

4. Discussione

ABCA1 e ABCG1 hanno un ruolo cruciale nel trasporto inverso del colesterolo dai tessuti periferici come i macrofagi al fegato. Tuttavia, l’espressione dei geni ABCA1 e ABCG1 è stata studiata in alcune malattie; non abbiamo trovato alcun rapporto su questo argomento nella sindrome metabolica. In questo studio, abbiamo esaminato l’espressione di questi geni in soggetti con sindrome metabolica e individui sani.

Mentre non c’era alcuna differenza significativa nell’espressione del gene ABCA1 tra i due gruppi studiati, abbiamo trovato un’espressione significativamente inferiore (circa il 75%) di ABCG1 nei soggetti con sindrome metabolica rispetto al gruppo di controllo. Singaraja et al. hanno dimostrato che la ridotta ABCA1 nei macrofagi e nei reni è associata ad un aumento del contenuto di colesterolo. Hanno concluso che l’esportazione del colesterolo mediata da ABCA1 potrebbe contribuire all’aumento dell’aterosclerosi e della nefropatia associate al diabete. Ci sono alcuni rapporti che cercano di affrontare i possibili meccanismi che regolano l’espressione di questi geni. Recentemente, è stato dimostrato che i polimorfismi in ABCA1 e ABCC8 possono essere associati alla sindrome metabolica. Ci sono prove che dimostrano che l’interruzione della funzione ABCA1, che può essere il risultato di una mutazione in questo gene, può portare alla ipoalfalipoproteinemia familiare che è caratterizzata da un basso livello di HDL e un aumento del deposito di esteri di colesterolo in diversi tessuti e cellule. Inoltre, è stato dimostrato che la sovraespressione del gene ABCA1 può conferire protezione contro l’aterosclerosi. Questi dati sono coerenti con i nostri risultati e sostengono l’idea che una minore espressione del gene ABCA1 può contribuire alle complicazioni della sindrome metabolica.

Haghpassand et al. hanno dimostrato che l’espressione del gene ABCA1 in PBMCs ha una relazione diretta con il carico di colesterolo, e la sovraespressione di ABCA1 porta al trasferimento del colesterolo in eccesso alle apoproteine. Wang et al. hanno studiato il trasporto inverso del colesterolo nei topi ABCA1 e ABCG1 knockdown e hanno concluso che quando sia ABCA1 che ABCG1 sono stati abbattuti, c’è un maggiore trasporto inverso del colesterolo rispetto a ABCG1 abbattuto .

Siccome Mauerer et al. hanno sottolineato che l’alto livello di glucosio (iperglicemia) è coinvolto nella ridotta espressione ABCA1 e ABCG1 in vitro, sembra logico aspettarsi cambiamenti simili nella MetS. I promotori di ABCA1 e ABCG1 hanno un sito recettore per LXR e RXR; quando l’ossicolesterolo e l’acido retinoico si uniscono a questi fattori, l’espressione di ABCA1 e ABCG1 è aumentata. Inoltre, cAMP e NFκB sono fattori trascrizionali per ABCA1 e ABCG1, rispettivamente.

I risultati ottenuti indicano una significativa diminuzione dell’espressione di ABCG1 nei pazienti con sindrome metabolica rispetto agli individui sani. Questi risultati suggeriscono che l’iperglicemia, i metaboliti correlati e l’iperlipidemia oltre la capacità del trasportatore possono portare a una diminuzione dell’espressione di ABCG1. Poiché nessun cambiamento significativo è stato osservato nell’espressione del gene ABCA1, può essere dovuto a un diverso meccanismo di regolazione. Poiché le strutture di questi geni sono diverse e sono regolate da diversi fattori trascrizionali, i nostri risultati possono essere giustificati. Tuttavia, il numero limitato dei campioni in questo studio è un altro fattore per l’assenza di cambiamenti nell’espressione di ABCA1.

L’altro punto è che abbiamo esaminato l’espressione di questi geni nei PBMC dei soggetti studiati; è importante notare che i cambiamenti nell’espressione di questi geni nei monociti possono essere diversi da quelli negli altri tessuti chiave come il fegato e l’intestino, che sono i principali siti di sintesi delle HDL. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di mRNA non implicano necessariamente cambiamenti nella relativa proteina.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non c’è conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo articolo è estratto dalla tesi di laurea di Zahra Tavoosi. Gli autori desiderano ringraziare l’Università di Hamadan delle Scienze Mediche per aver sostenuto finanziariamente questo studio.