Farmaci ricombinanti da cellule microbiche: un aggiornamento del 2015

Fabbriche di cellule

Dai primi tempi del DNA ricombinante, la comprensione sempre maggiore della fisiologia cellulare e dello stress, e dei fattori coinvolti nell’espressione genica eterologa e nella produzione di proteine ha potenziato l’uso di diverse fabbriche viventi, ovvero cellule procariotiche ed eucariotiche, piante o animali. Utilizzando questi sistemi, la produzione ricombinante risolve i problemi di disponibilità delle fonti, è considerata un processo bio-sicuro e verde e conferisce la capacità di modificare le sequenze di amminoacidi e quindi la funzione della proteina, per meglio adattare il prodotto ad una funzione desiderata. C’è un ampio e crescente spettro di sistemi di espressione che stanno diventando disponibili per la produzione di proteine ricombinanti. L’Escherichia coli era la piattaforma prevalente quando il settore biofarmaceutico è emerso negli anni ’80, ed è stato seguito dall’implementazione del lievito Saccharomyces cerevisiae. Entrambi i sistemi e le metodologie genetiche associate presentano una versatilità insolitamente elevata, che li rende adattabili a diverse esigenze di produzione. Nonostante l’esplorazione delle cellule di insetto come sistema di successo iniziale, specialmente per le proteine orientate al vaccino, le linee cellulari di mammiferi (in particolare le cellule CHO) sono oggi il sistema cellulare di derivazione animale prevalente grazie alla loro idoneità a produrre proteine convenientemente glicosilate (Fig. 1). La capacità di effettuare modifiche post-traduzionali contrasta con i complessi requisiti nutrizionali, la crescita lenta e la fragilità, e i tempi e i costi di produzione relativamente alti. Così, tra i molti sistemi convenzionali ed emergenti basati su cellule per la produzione di proteine, i batteri, il lievito e le linee cellulari di mammiferi sono i più comuni nel biofarma, ed entrambi i sistemi procarioti ed eucarioti sono in costante evoluzione e in competizione per migliorare le loro proprietà e intensificare come piattaforme di scelta per la produzione di farmaci proteici. Mentre i batteri hanno perso il loro primo ruolo di primo piano nel campo, circa il 30% dei biofarmaci commercializzati sono ancora prodotti in questo sistema, come sostenuto dall’insolita manipolabilità fisiologica e genetica delle cellule procariotiche.

In effetti, lo scopo principale nello sviluppo di nuove piattaforme di produzione di proteine è quello di migliorare la funzionalità dei farmaci attraverso il raggiungimento del successo del folding delle proteine e delle modifiche post-traslazionali, pur mantenendo la bassa complessità e l’alta flessibilità associate alla coltura cellulare procariotica. In questo contesto, i batteri Gram-positivi come Bacillus megaterium e Lactococcus lactis permettono un’efficiente secrezione proteica in assenza di componenti endotossici della parete cellulare, mentre i funghi filamentosi (come Trichoderma reesei, ), muschio (Physcomitrella patens, ) e protozoi (Leishmania tarentolae, ) promuovono modelli di glicosilazione simili a quelli delle proteine dei mammiferi, ma essendo ancora coltivati attraverso metodi più semplici di quelli richiesti dalle cellule dei mammiferi. Estese descrizioni di piattaforme emergenti (batteriche e non batteriche) specificamente indirizzate alla produzione di farmaci proteici di alta qualità possono essere trovate altrove. Il recente sviluppo di un ceppo di E. coli privo di endotossine e la sua applicazione alla fabbricazione di proteine e materiali proteici apre la strada a una produzione efficiente e versatile di proteine destinate a usi biomedici, saltando le fasi di rimozione delle endotossine, guadagnando così in biosicurezza e riducendo i costi di produzione. Si spera che tutti questi nuovi sistemi possano presto offrire prodotti migliori in approcci di biofabbricazione ancora semplici e completamente controllati.

Tendenze nei biofarmaci proteici

Circa 400 prodotti a base di proteine ricombinanti sono stati prodotti con successo e sono approvati come biofarmaci, un termine che si riferisce a prodotti terapeutici generati da tecnologie che coinvolgono organismi viventi. Altre 1300 proteine candidate sono in fase di sviluppo, di cui circa il 50% sono in studi preclinici e il 33% in studi clinici (Fig. 2). In questo contesto, è prevedibile un aumento del numero di approvazioni nei prossimi anni. Sviluppato da Eli Lilly & Co negli anni 70, Humulin, un’insulina umana ricombinante fabbricata nel batterio E. coli, è stato il primo biofarmaco approvato (dalla FDA) nel 1982. Altre proteine naturali come ormoni, citochine e anticorpi (Orthoclone OKT3) furono tra i nove prodotti approvati negli anni ’80 (tabella 1). Oggi, le aree terapeutiche che hanno beneficiato maggiormente dei biofarmaci ricombinanti sono i disturbi metabolici (ad esempio il diabete di tipo 1, di tipo 2, l’obesità o l’ipoglicemia), i disturbi ematologici (ad esempio l’anemia renale, l’emofilia A, i disturbi del sanguinamento o della coagulazione) e l’oncologia (ad esempio il melanoma, il cancro al seno o al colon-retto), con il 24, 18 e 15 % delle approvazioni rispettivamente (Fig. 3). A questo proposito, l’oncologia è un mercato in chiara espansione. Nel periodo 2010-2014, 9 dei 54 biofarmaci approvati erano farmaci antitumorali, e il cancro rappresenta l’indicazione più comune in questo periodo. Scavando nelle basi molecolari dei biofarmaci, c’è una chiara tendenza verso prodotti basati su anticorpi. Nello stesso periodo (2010-2014), 17 dei 54 farmaci proteici approvati erano anticorpi monoclonali (31,5%), rispetto all’11% del periodo 1980-1989. Inoltre, tra i primi dieci biofarmaci proteici venduti a livello globale nel 2014 (tabella 2), sei sono anticorpi o proteine derivate da anticorpi (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

In precedenza, i biofarmaci erano versioni ricombinanti di proteine naturali, con la stessa sequenza aminoacidica delle rispettive versioni native (con solo piccole modifiche, spesso derivanti dalla strategia di clonazione). Dagli anni ’90, una parte significativa delle approvazioni si basa su forme altamente modificate di proteine ricombinanti. Questa nuova alternativa, basata sulla fusione di proteine o domini e su versioni troncate, offre un ampio spettro di combinazioni possibili per ottenere nuovi biofarmaci con diverse attività congiunte che non si trovano insieme in natura.

Farmaci proteici per il trattamento del cancro

L’oncologia è una delle indicazioni terapeutiche che dominano il mercato biofarmaceutico, poiché il cancro è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. La chirurgia e la radioterapia sono efficaci nel curare il cancro nelle fasi iniziali della malattia; tuttavia, non possono sradicare la malattia metastatica. La presenza di micrometastasi o di metastasi clinicamente evidenti alla diagnosi richiede il loro uso in combinazione con la chemioterapia genotossica per aumentare i tassi di guarigione. Tuttavia, il successo della chemioterapia è stato ostacolato dalla sua mancanza di selettività e specificità, per cui la tossicità per i tessuti normali limita la dose che potrebbe essere somministrata ai pazienti. Lo sviluppo di biofarmaci in grado di inibire specifici bersagli molecolari che guidano il cancro (per esempio, anticorpi monoclonali anti-Her2-Trastuzumab- o anti-VEGF-Bevacizumab-) va in questa direzione .

Tra i biofarmaci proteici commercializzati, quasi il 24% (94 prodotti) sono utilizzati nelle terapie antitumorali. La maggior parte di questi prodotti sono utilizzati per scopi di supporto destinati a minimizzare gli effetti collaterali della chemioterapia, di solito neutropenia o anemia (alcuni esempi rappresentativi sono riportati nella tabella 3). Diciannove di questi 94 prodotti sono veri e propri farmaci antitumorali, il 69% dei quali sono prodotti in E. coli (Fig. 4) e sono basati su sequenze aminoacidiche ingegnerizzate, fusioni di proteine e domini di singole proteine (Tabella 4).

Chiaro, le versioni modificate delle proteine sono le più abbondanti nelle terapie del cancro rispetto ai polipeptidi naturali. Come esempi rilevanti, Ziv aflibercept è una proteina di fusione ricombinante prodotta in cellule CHO utilizzata contro il cancro colorettale. Consiste di porzioni di ciascun recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR1 e VEGFR2) fuse alla frazione costante (Fc) di un’immunoglobulina umana IgG1 (Fig. 5). Questo costrutto agisce come esca legandosi a VEGF-A, VEGF-B e al fattore di crescita placentare (PlGF), che attivano il VEGFR. Questa trappola ostacola l’interazione tra i fattori di crescita e i recettori, inibendo il percorso del VEGF che è coinvolto nel processo angiogenico. Denileukin diftitox è una proteina ricombinante composta da due frammenti di tossina difterica (A e B) e una interleuchina-2 umana (Fig. 5). La tossina difterica è una potente esotossina secreta dal Corynebacterium diphteriae. Grazie alla sua particolare struttura, l’intero complesso, prodotto in E. coli, è in grado di fornire un agente citotossico direttamente a un bersaglio specifico. Ci sono due blocchi attivi principali la cui funzione è in primo luogo di consegnare selettivamente il biofarmaco (IL-2) e in secondo luogo di causare citotossicità (tossina A e B). La proteina di fusione si lega al recettore dell’IL-2, che è espresso nelle cellule cancerose (linfoma cutaneo a cellule T). Una volta che la parte della tossina viene internalizzata, il dominio catalitico promuove la morte cellulare attraverso l’inibizione della sintesi proteica.

Poiché la somministrazione mirata di farmaci per il cancro è un’area di ricerca più recente e in espansione, anche altri biofarmaci non ricombinanti a base di proteine sono fortemente rappresentati. Questi includono principalmente coniugati anticorpo-farmaco (ADC) come Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine, o coniugati nanoparticella-farmaco come nab-paclitaxel . In questi casi, la controparte proteica funge da veicolo mirato per i farmaci chimici convenzionali. Anche in questo caso, questo approccio persegue la consegna selettiva del farmaco a specifiche cellule bersaglio, al fine di aumentare l’attività antitumorale riducendo la tossicità sulle cellule normali e gli effetti collaterali associati.

I prodotti contro il cancro che hanno fornito i maggiori ricavi nel 2013 sono rappresentati in Fig. 6. Il sessanta per cento di questi prodotti sono proteine ricombinanti, sostenendo l’idea che la produzione di proteine ricombinanti è ancora una piattaforma in ascesa e promettente, che offre spazio per importanti progressi nel settore biofarmaceutico.