Frontiers in Oncology

Introduzione

I gliomi sono i più comuni tumori intracranici e rappresentano circa il 70% di tutti i tumori primari del cervello (1, 2). È noto che la resezione totale lorda è correlata a una migliore sopravvivenza libera da progressione e complessiva nei pazienti con gliomi a basso grado (LGG) (3-6). Pertanto, la resezione massima sicura dei LGG è considerata oggi come il trattamento primario raccomandato per ritardare la potenziale trasformazione maligna (7, 8). Tuttavia, tale resezione massima sicura si ottiene solo nella minoranza delle LGG a causa della loro crescita infiltrativa e dei confini indefiniti (9).

La chirurgia che utilizza la fluorescenza dell’acido 5-aminolevulinico (ALA) indotta dalla protoporfirina IX (PpIX) è stata introdotta nel campo neurochirurgico per una migliore visualizzazione intraoperatoria del tumore (10). Negli ultimi due decenni, tali resezioni guidate dalla fluorescenza sono state applicate soprattutto per ottimizzare la chirurgia dei gliomi ad alto grado (HGG) (11). In questo senso, la chirurgia guidata dalla fluorescenza 5-ALA si traduce in una frequenza significativamente più alta di resezioni complete e una sopravvivenza libera da progressione prolungata nei gliomi ad alto grado (12-17). Negli ultimi anni, il 5-ALA è stato anche sempre più studiato durante la chirurgia delle LGG radiologicamente sospette (3, 7, 11, 13, 18-21). Secondo i dati di questi primi studi clinici, la fluorescenza indotta dal 5-ALA è un potente marcatore per identificare potenziali regioni di trasformazione maligna (focolai anaplastici) durante la chirurgia delle LGG sospette e quindi per evitare l’indegradazione istopatologica. Tuttavia, la maggior parte delle LGG pure non può essere visualizzata dalla fluorescenza visibile secondo la letteratura attuale (3, 7, 11, 13, 18, 19, 21, 22).

I meccanismi esatti dell’accumulo di PpIX e quindi la presenza o assenza di fluorescenza visibile indotta da 5-ALA nei gliomi non sono ancora chiari. Una grande varietà di fattori è stata sospettata di influenzare la fluorescenza visibile di 5-ALA come l’aumento del metabolismo e l’up-regolazione degli enzimi produttori di porfirina (23), il ridotto metabolismo del ferro all’interno delle cellule neoplastiche (24), e la riduzione dell’attività dell’enzima ferrochelatasi che converte la PpIX fluorescente in eme (25). Recentemente, uno studio in vitro ha riportato che i farmaci antiepilettici (AED) provocano una lesione della membrana mitocondriale e quindi portano all’inibizione della sintesi di PpIX nelle cellule di glioma (26). Al giorno d’oggi, i DAE sono frequentemente somministrati ai pazienti affetti da LGG prima della chirurgia. Noi ipotizziamo che la somministrazione di AEDs potrebbe influenzare la presenza di fluorescenza visibile in LGGs durante la resezione chirurgica.

Lo scopo del presente studio è stato quindi quello di indagare il ruolo della fluorescenza 5-ALA indotta nella chirurgia LGG e analizzare l’influenza di AEDs sulla presenza di fluorescenza visibile.

Materiali e metodi

Popolazione di pazienti

Sono stati reclutati pazienti sottoposti a resezione di un sospetto LGG di nuova diagnosi presso l’Istituto Neurochirurgico Burdenko dopo la somministrazione di 5-ALA tra marzo 2014 e marzo 2016. Nel nostro studio, alla fine sono stati inclusi 27 pazienti con una LGG confermata istopatologicamente. La nostra coorte di studio comprendeva 19 uomini e otto donne con un’età mediana di 33 anni (range: 18-66 anni). Secondo la nostra analisi istopatologica, sono stati diagnosticati 14 astrocitomi diffusi, 6 oligodendrogliomi, 4 astrocitomi pilocitici, 2 astrocitomi gemistocitari e un ganglioglioma infantile desmoplastico. L’applicazione del 5-ALA durante l’intervento è stata possibile in tutti i 27 pazienti. In nessuno dei nostri pazienti si sono verificati effetti collaterali significativi legati al 5-ALA nel nostro studio. Il consenso informato per la procedura chirurgica e la somministrazione del 5-ALA è stato ottenuto da tutti i pazienti. Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale del N. N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery (Mosca, Russia).

Criteri di inclusione ed esclusione

I criteri di inclusione per l’arruolamento in questo studio erano età ≥18 anni, MRI-sospetto LGG, possibile resezione totale lorda (GTR) (cioè, >90%) come giudicato dalla stima chirurgica preoperatoria, assenza di qualsiasi storia nota di malattia epatica o segni di disfunzione epatica significativa e scala Karnofsky ≥70. I criteri di esclusione per la somministrazione di 5-ALA erano la storia di fotosensibilità, paziente o storia familiare di porfiria, gravidanza e allattamento. Solo i pazienti con diagnosi di LGG dopo l’intervento chirurgico sono rimasti nella coorte finale dello studio.

Procedimento chirurgico

I pazienti sono stati somministrati per via orale 25 mg/kg di peso corporeo 5-ALA (“Alasence” NIOPIK, Mosca, Russia) sciolto in 100 ml di acqua ~3 ore prima dell’intervento. A seconda della localizzazione del tumore, neuromonitoraggio intraoperatorio con potenziali evocati sensoriali/motori, e/o stimolazione diretta (Viking Select, Nicolet; n = 21 pazienti) così come la chirurgia sveglia (n = 2 pazienti) è stata eseguita. È stato utilizzato un microscopio neurochirurgico modificato (Carl Zeiss OPMI Pentero, Germania) dotato di un modulo di luce UV 400 nm fluorescente e filtri specifici. La rimozione microchirurgica del tumore è stata eseguita utilizzando principalmente la microscopia standard a luce bianca con l’assistenza della neuronavigazione nella maggior parte dei casi (n = 20 pazienti). Durante la chirurgia, il microscopio è stato commutato ripetutamente alla luce di eccitazione viola-blu per visualizzare la fluorescenza potenziale.

L’intensità della fluorescenza è stata valutata visivamente da un chirurgo e determinata come “debole” con solo una piccola parte del tumore che mostra la fluorescenza rosa con la sua massa non fluorescente a tutti, “moderata” con più della metà del tumore rivelando la fluorescenza rosa, e “brillante” con la maggior parte del tumore guardando rosso brillante. La fluorescenza assistita da spettroscopia è stata valutata quantitativamente in 12 pazienti. Il livello di fluorescenza variava da 0 valori fino a 15 unità arbitrarie (dopo la normalizzazione dei dati) rispetto al cervello intatto. In particolare non abbiamo evidenziato il ruolo della spettroscopia, poiché è stata eseguita solo in alcuni dei nostri pazienti. Inoltre, anche l’omogeneità di fluorescenza intratumorale di ogni tumore è stata determinata. In questo senso, la fluorescenza diffusa è stata definita come un bagliore omogeneo dell’intero tumore. Al contrario, la fluorescenza focale è stata definita come un’area circoscritta di fluorescenza all’interno di un tumore altrimenti non fluorescente. Nel corso della chirurgia, campioni di tessuto da aree fluorescenti e/o non fluorescenti all’interno del tumore e/o il confine tumorale presunto sono stati successivamente raccolti per l’analisi istopatologica. Per evitare la potenziale fototossicità legata al 5-ALA, tutti i pazienti sono stati protetti da forti fonti di luce per almeno 24 ore dopo la somministrazione del farmaco.

Istopatologia

Tutti i campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina sono stati trattati per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E). La diagnosi del tumore è stata stabilita da un neuropatologo esperto secondo gli attuali criteri istopatologici dell’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) (27). Nel nostro studio, la densità cellulare e il tasso di proliferazione (indice di etichettatura Ki-67) è stato studiato in ciascuno dei campioni di tessuto raccolti.

Assunzione preoperatoria di AEDs

Siccome l’obiettivo principale del nostro studio era quello di indagare la potenziale influenza di AEDs sulla fluorescenza 5-ALA indotta, abbiamo documentato in ogni paziente se AEDs sono stati somministrati prima della chirurgia (sì o no). I pazienti sono stati ingeriti dosaggi medi AED: acido valproico (fino a 1,5 mg al giorno), levetiracetam (800 mg al giorno). Non abbiamo studiato ogni farmaco separatamente, come la serie generale non era grande.

Corso postoperatorio

Lo stato neurologico di ogni paziente è stato studiato prima e dopo l’intervento chirurgico per rilevare il potenziale deterioramento postoperatorio dei sintomi neurologici. Inoltre, l’estensione della resezione è stata giudicata in base ai risultati di una risonanza magnetica post-operatoria precoce (fino a 72 ore dopo l’intervento): (1) GTR era presente se almeno il 90% della massa tumorale è stato rimosso, (2) resezione subtotale se più del 50% della massa tumorale è stato resecato, e (3) resezione parziale se <50% del tumore è stato rimosso.

Analisi statistica

L’elaborazione dei dati è stata eseguita utilizzando il software R per il calcolo statistico (versione 3.4.4). Le variabili continue sono state confrontate in gruppi utilizzando il test U di Mann-Whitney. Per analizzare la relazione tra le variabili categoriche, è stato applicato il test esatto di Fisher. È stata eseguita un’analisi di regressione logistica per aggiustare i fattori di confondimento quando si è verificato l’effetto del DAE sulla fluorescenza. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi per p < 0,05.

Risultati

5-ALA Fluorescenza indotta e diagnosi istopatologica

Abbiamo osservato una fluorescenza visibile durante la chirurgia in 14 (52%) dei 27 casi, mentre nessuna fluorescenza è stata rilevata nei restanti 13 casi (48%).

Secondo la diagnosi istopatologica del tumore, tutti i 4 astrocitomi pilocitici, tutti i 2 astrocitomi gemistocitici e l’unico ganglioglioma infantile desmoplastico hanno mostrato una fluorescenza visibile. Inoltre, la fluorescenza visibile è stata trovata in 4 (29%) dei 14 astrocitomi diffusi e in 3 (50%) dei 6 oligodendrogliomi. Secondo l’omogeneità di fluorescenza intratumorale (n = 14 casi), 7 tumori avevano una fluorescenza visibile “diffusa”, mentre gli altri 7 gliomi avevano siti “focali” di fluorescenza visibile. I dettagli sui dati di fluorescenza della nostra coorte sono forniti nella Tabella 1 e casi illustrativi nella Figura 1.

5-ALA Fluorescenza indotta e parametri istologici

In totale, 80 campioni di tessuto sono stati raccolti durante l’intervento chirurgico da 27 pazienti (mediana: 3 campioni; range 1-12 campioni per paziente). Di questi, la fluorescenza visibile è stata trovata in 21 campioni (26%), mentre 59 campioni (74%) non hanno mostrato alcuna fluorescenza visibile. La densità cellulare era significativamente più alta nei campioni positivi alla fluorescenza (2.180 mm2) rispetto ai campioni negativi alla fluorescenza (1.510 mm2; p = 0,03). Inoltre, il tasso di proliferazione valutato dall’indice di etichettatura Ki-67 era anche significativamente più alto nei campioni positivi alla fluorescenza (2,52%) rispetto ai campioni negativi alla fluorescenza (0,41%; p = 0,04).

5-ALA Fluorescenza indotta e AEDs

A causa di una storia precedente di crisi preoperatorie, 15 pazienti (56%) della nostra coorte di studio stavano prendendo AEDs prima della chirurgia (finlepsin, levetiracetam, trileptal, e/o acido valproid). Dei 15 pazienti con assunzione preoperatoria di AED, 11 pazienti (73%) non hanno mostrato alcuna fluorescenza visibile durante la resezione. Al contrario, 10 (83%) dei restanti 12 pazienti senza precedente assunzione di AEDs hanno mostrato fluorescenza visibile. Così, la fluorescenza visibile era significativamente più comune nei pazienti senza assunzione di AEDs rispetto ai pazienti con assunzione preoperatoria AED. L’AED ha mostrato di essere un fattore significativo (p = 0,048) che influenza la probabilità di fluorescenza intraoperatoria quando aggiustato per altri potenziali confondenti (astrocitoma/non-astrocitoma, localizzazione frontale, dose di desametasone) in un modello di regressione logistica. Gli altri fattori inclusi nel modello non hanno mostrato una relazione significativa con la fluorescenza (p > 0,05).

Corso postoperatorio

Dopo l’intervento, 21 pazienti hanno mostrato sintomi neurologici stabili e quattro pazienti migliorati. Al contrario, il deterioramento dei sintomi neurologici è stato trovato nei due pazienti rimanenti. Secondo la risonanza magnetica postoperatoria precoce, la resezione totale lorda è stata ottenuta in 16 pazienti (59%), la resezione subtotale in 8 pazienti (30%), e la resezione parziale in tre pazienti (11%). La fluorescenza non ha correlato con l’estensione della resezione.

Discussione

L’uso della fluorescenza indotta da 5-ALA sta diventando sempre più popolare con l’obiettivo di massimizzare l’estensione della resezione soprattutto nelle HGGs e quindi migliorare la prognosi post-operatoria del paziente. In questo senso, la chirurgia guidata dalla fluorescenza ha dimostrato di migliorare significativamente il tasso di resezioni complete nelle HGG rispetto alla sola microchirurgia, e questa tecnica innovativa ha anche quasi raddoppiato la sopravvivenza libera da progressione a 6 mesi (16). Recentemente, la fluorescenza PpIX visibile è stata trovata anche in altre lesioni cerebrali come i meningiomi (19), e tumori metastatici (18, 28).

Letteratura corrente: Fluorescenza del 5-ALA nel LGG

Finora, il valore della fluorescenza indotta dal 5-ALA nel LGG è stato indagato solo in pochi studi. In questo senso, Ishihara et al. hanno descritto per la prima volta nel 2007 l’applicazione del 5-ALA in due LGG e non hanno trovato alcuna fluorescenza visibile nei molteplici campioni di tessuto raccolti (29). Inoltre, Ruge et al. hanno pubblicato nel 2009 un case report di una bambina di 9 anni sottoposta a resezione guidata da fluorescenza di uno xantoastrocitoma pleomorfo del lobo temporale destro e hanno rilevato una fluorescenza visibile del tumore (20). Inoltre, Stockhammer et al. hanno pubblicato nel 2009 un case report di un astrocitoma diffuso WHO grado II con moderata densità cellulare, maggiore densità microvascolare e fluorescenza visibile (30). Casi di fluorescenza di astrocitoma pilomissoide e astrocitoma pilocitico sono stati pubblicati da Bernal Garcia et al. (31) e Choo et al. (32), rispettivamente. La prima serie di pazienti con LGG e 5-ALA è stata pubblicata da Widhalm et al. (33). In questo studio, tutti gli otto gliomi di grado II dell’OMS diffusamente infiltranti non hanno mostrato alcuna fluorescenza visibile indotta dal 5-ALA durante la chirurgia. In un ulteriore studio, Ewelt et al. hanno riportato nel 2011 una fluorescenza visibile in un solo (8%) di 13 LGG durante la chirurgia (7). Tre anni dopo la prima serie di pazienti, Widhalm et al. hanno pubblicato una serie più ampia nel 2013 e hanno trovato una fluorescenza visibile in 4 (9%) di 33 LGG (34). In un altro studio di Marbacher et al., 8 (40%) di 20 LGG hanno mostrato fluorescenza visibile (18). Nel 2015, Valdes ha fondato una fluorescenza visibile in 4 (33%) di 12 LGG analizzate (35). Infine, Jaber et al. hanno trovato nel 2016 nella più grande serie fino ad oggi la fluorescenza visibile in 13 (16%) di 82 LGGs (36). Quindi, secondo la letteratura attuale la fluorescenza visibile si osserva solo in una minoranza di pazienti con LGG.

Studio attuale: 5-ALA Fluorescence in LGG

Nonostante questi altri studi disponibili nella letteratura corrente, i nostri dati hanno mostrato la presenza di fluorescenza visibile in più della metà dei nostri casi durante l’intervento. Una possibile spiegazione per il più alto tasso di LGG con fluorescenza visibile rispetto alla letteratura attuale potrebbe essere che abbiamo usato una dose leggermente superiore di 5-ALA (25 mg/kg di peso corporeo) rispetto agli altri studi (18, 33, 34). Tuttavia, Stummer et al. hanno confrontato diverse dosi di 5-ALA nella chirurgia del glioma maligno (0,2, 2, 20 mg/kg) e hanno concluso che l’uso di dosi di 5-ALA superiori a 20 mg/kg di peso corporeo probabilmente non porterebbe a un effetto di fluorescenza migliore (37). Un’altra spiegazione potrebbe essere che abbiamo incluso anche altre entità tumorali oltre ai gliomi diffusamente infiltranti come gli astrocitomi pilocitici o un ganglioglioma. I nostri risultati promettenti devono essere confermati, tuttavia, in studi multicentrici indipendenti tra cui una coorte più grande di pazienti affetti da LGG.

Interessante, abbiamo osservato la fluorescenza visibile non solo in aree intratumorali focali come precedentemente descritto (33, 34), ma anche la fluorescenza diffusa con incandescenza omogenea del tumore intero. Supponiamo che la presenza di fluorescenza visibile focale nella LGG potrebbe rappresentare aree di potenziale futura trasformazione maligna. Inoltre, gli studi futuri dovrebbero chiarire se l’estensione della resezione potrebbe essere ottimizzata soprattutto nelle LGG con un modello di fluorescenza diffusa.

5-ALA Fluorescenza e istopatologia

Nel nostro studio, abbiamo osservato livelli significativamente più alti di densità cellulare e proliferazione nei campioni con fluorescenza visibile rispetto a quelli senza fluorescenza. Questo è in linea con i due studi precedenti di Widhalm et al (33, 34). Allo stesso modo, Widhalm et al hanno trovato un tasso mitotico, una densità cellulare e un pleomorfismo nucleare significativamente più elevati nei campioni con fluorescenza rispetto ai campioni non fluorescenti. Inoltre, l’indice di proliferazione valutato da MIB-1 LI era significativamente più alto nei campioni con fluorescenza visibile rispetto ai campioni non fluorescenti. In questo senso, questi dati precedenti indicano che la fluorescenza visibile è in grado di identificare i focolai anaplastici secondo i criteri istopatologici dell’OMS (33, 34). Poiché abbiamo anche trovato una densità cellulare e un tasso di proliferazione significativamente più alti nelle aree di fluorescenza visibile in una serie di LGG, crediamo che il 5-ALA potrebbe servire come un marker precoce di trasformazione maligna in corso di una LGG iniziale. Studi futuri con dati sufficienti sul follow-up sono necessari per chiarire questa importante questione.

5-ALA Fluorescenza e AEDs

Al giorno d’oggi, è pratica comune per i pazienti con LGG avere un trattamento medico delle crisi epilettiche (38-40). Hefti et al. hanno dimostrato in uno studio in vitro che la sintesi di PpIX era ridotta fino al 45% nelle cellule di glioma sotto l’effetto della fenitoina, ma non del levetiracetam (26). Nel nostro studio, abbiamo trovato che la fluorescenza visibile era significativamente più comune nei pazienti senza assunzione di AEDs rispetto ai pazienti con assunzione preoperatoria di AEDs (r = 0,56; p = 0,045). Dei 15 pazienti con assunzione preoperatoria di AED, 11 pazienti (73%) non hanno mostrato alcuna fluorescenza visibile durante la resezione. Al contrario, 10 (83%) dei restanti 12 pazienti senza precedente assunzione di AEDs ha mostrato fluorescenza visibile. I meccanismi sottostanti l’influenza osservata di AEDs sulla fluorescenza visibile non è chiaro finora. L’influenza dei DAE sulle attività della deidrasi dell’acido 5-aminolevulinico e della sintetasi dell’uroporfirinogeno I negli eritrociti di un ragazzo epilettico carente di vitamina B6 cui erano stati somministrati acido valproico e carbamazepina è stata descritta anche da Haust et al. della University of Western Ontario, Canada nel 1989 (41). Una possibile ipotesi potrebbe essere che i DAE abbiano un’influenza sugli enzimi della sintesi di PpIX nei mitocondri delle cellule di glioma e quindi determinano la presenza o l’assenza di fluorescenza nella LGG. Un ulteriore studio su linee cellulari di glioblastoma ha scoperto che i DAE (fenitoina/valproati) e il desametasone possono inibire la sintesi di PpIX (10). I meccanismi esatti dell’influenza dei DAE sulla fluorescenza visibile devono essere chiariti in studi futuri.

Direzioni future

In futuro, le nostre prime osservazioni dovrebbero essere confermate in ulteriori studi indipendenti con una grande coorte di pazienti. Tali studi più grandi permettono anche la possibilità di analizzare l’influenza di diversi tipi di AED separatamente. Inoltre, l’influenza di AEDs dovrebbe anche essere studiato in HGGs. Nei casi con mancanza di fluorescenza visiva, metodi di rilevamento quantitativo potrebbe essere utile per una migliore visualizzazione del tessuto LGG. In questo senso, la microscopia confocale è anche un potente strumento per visualizzare la fluorescenza tumorale 5-ALA-indotta all’interno di LGGs e all’interfaccia cervello-tumore (21). Tuttavia, dati convincenti di microscopia confocale in una grande coorte di pazienti con LGG sono ancora mancanti finora. Un altro metodo rappresenta l’analisi spettroscopica dell’accumulo di PpIX con sonde specifiche. Con questo approccio, Valdes et al. hanno scoperto che l’accumulo di PpIX può essere rilevato quantitativamente nonostante la scarsa accuratezza diagnostica della fluorescenza visiva nelle LGG (35, 42). Di conseguenza, questo approccio promettente merita ulteriori indagini in studi futuri.

Conclusioni

Nel presente studio, abbiamo studiato il ruolo del 5-ALA nelle LGG e l’influenza dei farmaci antiepilettici sulla fluorescenza intraoperatoria. Secondo i nostri dati, abbiamo osservato un tasso nettamente superiore di fluorescenza visibile nella nostra serie di LGGs (52%) rispetto alla letteratura corrente. Inoltre, è stata notata una maggiore densità e proliferazione cellulare nelle aree di fluorescenza visibile. Così, 5-ALA fluorescenza indotta potrebbe anche migliorare la visualizzazione intraoperatoria di un sottogruppo di LGGs e potrebbe essere anche un marcatore utile per il rilevamento ottimizzato di eterogeneità istopatologica durante la chirurgia di LGGs. Inoltre, l’assunzione preoperatoria di AEDs sembra ridurre la presenza di fluorescenza visibile in tali tumori secondo i nostri dati preliminari e quindi questo problema dovrebbe essere preso in considerazione nel contesto clinico. Inoltre, sono necessari studi multicentrici indipendenti che includano una coorte più ampia di pazienti con LGG per confermare i dati promettenti di questo studio.

Limitazioni

Capiamo che l’analisi dei fattori che influenzano la fluorescenza dovrebbe essere multipla. Per raggiungere ciò, abbiamo usato il modello di regressione logistica. AED ha dimostrato di essere un fattore significativo che influenza la probabilità di fluorescenza intraoperatoria, quando aggiustato per altri potenziali confondenti (astrocitoma/non-astrocitoma, localizzazione frontale, dose di desametasone, IDH1-mutazione) in un modello di regressione logistica. La densità cellulare e l’indice Ki67 sono stati rivelati solo nei pazienti con biopsie multiple (10 pazienti). Si è concluso che la densità cellulare e l’indice Ki67 erano più alti per i campioni bioptici presi dalla zona fluorescente rispetto a quella non fluorescente. Abbiamo poche prove sulla densità cellulare per i restanti 17 pazienti, con il loro indice Ki67 che costituisce principalmente il 4-5%. Poiché si tratta di un’analisi retrospettiva che arruola 27 pazienti, non abbiamo previsto di studiare la densità cellulare e l’indice Ki67. Sfortunatamente, non abbiamo un set di dati completo per il Ki67 e la densità cellulare da includere in un modello di regressione logistica.

Dichiarazione etica

Questo studio è stato condotto comitato locale del N. N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery (Mosca, Russia) con consenso informato scritto da tutti i soggetti. Tutti i soggetti hanno dato il consenso informato scritto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Il protocollo è stato approvato dal comitato locale del N. N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery (Mosca, Russia).

Contributi degli autori

SG, GW, e AP hanno progettato lo studio. LS, VJ e MR hanno raccolto i dati. TS, VL, GP e AR hanno elaborato i dettagli tecnici. MG e DC hanno analizzato i dati e scritto il documento con il contributo di tutti gli autori. AS e AP hanno modificato il testo. KC ha analizzato i dati e ha scritto l’articolo con il contributo di tutti gli autori.

Finanziamento

Lo studio riportato è stato finanziato da RFBR secondo i progetti di ricerca No. 17-00-00158, No.17-00-00159, e 17-00-00157.

Conflict of Interest Statement

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgments

Vogliamo riconoscere l’aiuto fornito dai nostri colleghi: Danilov G. V., MD, Ph.D., N. N. Burdenko Scientific Research Neurosurgery Institute, Mosca, Russia per il supporto statistico.