Frontiers in Pharmacology

Introduzione

L’uso di rimedi naturali è un’antica tradizione ancora in pratica, con >60% della popolazione mondiale che affronta vari problemi di salute, compreso il cancro, usando la medicina tradizionale come prima scelta (Sultana et al., 2014). Tuttavia, il trattamento del cancro è complesso, e le possibilità attuali per i pazienti dipendono dal tipo di cancro e dallo stadio, oltre che dall’età, dal sesso e dalla salute generale del paziente. Anche se la chemioterapia ha solitamente successo durante le prime fasi del cancro, la sua efficacia dipende dallo schema di somministrazione del farmaco e dalle condizioni fisiologiche del paziente. Tuttavia, la principale preoccupazione riguardo alla chemioterapia è la sua tossicità, poiché i farmaci impiegati tendono a colpire sia le cellule cancerose che quelle normali, con un alto indice di proliferazione che genera danni collaterali nei pazienti. Inoltre, le cellule tumorali possono sviluppare resistenza al trattamento, esibendo metastasi, e quindi diminuendo la risposta al trattamento e riducendo la possibilità di sopravvivenza libera da malattia. Pertanto, una delle sfide chiave nella scoperta dei farmaci è la riduzione della tossicità degli agenti chemioterapici e lo sviluppo di farmaci più efficaci ed efficienti per migliorare i trattamenti, i tempi di recupero e la qualità complessiva della vita dei pazienti.

I prodotti naturali hanno fornito una ricca fonte di strutture chimiche per lo sviluppo di trattamenti anticancro. Nell’area della farmaceutica oncologica, il 49% dei farmaci impiegati nella chemioterapia sono derivati o ispirati da fonti naturali come piante, microrganismi e organismi marini (Newman e Cragg, 2016). Gli esempi includono gli alcaloidi della vinca e i taxani (agenti leganti la tubulina), oltre alle podofillotossine, alle antracicline e agli etoposidi (inibitori della topoisomerasi) (Da Rocha et al., 2001; Nobili et al., 2009). Questi esempi illustrano il potenziale dei prodotti naturali nella scoperta di farmaci.

Gli AA sono metaboliti secondari prodotti dalla famiglia delle Annonaceae (Figura 1). Nella medicina tradizionale, il frutto del genere Annona è usato per il trattamento di febbre, dolore, reumatismi, diarrea e artrite, e le sue foglie per il diabete, mal di testa e insonnia (Moghadamtousi et al., 2015a). Annona reticulate è stata impiegata in Africa come trattamento anti-dissenterico e antielmintico, e A. squamosa è usata in India per il trattamento di varie condizioni tra cui i tumori maligni (Savithramma et al., 2011). Inoltre, A. muricata è un rimedio medicinale popolare in America, Africa e India per il trattamento del cancro (Moghadamtousi et al., 2015a), mentre in Messico, A. macroprophyllata, A. muricata e A. purpurea sono utilizzate per il trattamento dei tumori della pelle e del cancro gastrico (Alonso-Castro et al., 2011; Brindis et al., 2013). Secondo una revisione etnofarmacologica delle piante medicinali in Messico, il genere Annona potrebbe anche essere esplorato per il trattamento del cancro al colon (Jacobo-Herrera et al., 2016). Queste evidenze indicano che gli AA sono molecole con un significativo potenziale bioattivo.

Sono stati descritti ad oggi oltre 500 AA; questi composti sono caratterizzati da una lunga catena alifatica con un anello α, β-insaturo γ-lattone e anelli 0-3 tetraidrofurano (THF) (Yuan et al, 2015), e hanno mostrato attività citotossica contro diverse linee cellulari di cancro umano (cioè, polmone, seno, colon, rene, pancreas, prostata, fegato e vescica) (rivisto in Zeng et al, 1996; Chávez e Mata, 1998; Wang et al., 2002; Yuan et al., 2003; Mangal et al., 2016; Miao et al., 2016a; Miao et al., 2016b) oltre all’attività antitumorale in vivo (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b). Qui, abbiamo esaminato i rapporti più recenti sugli AA nel campo della scoperta di farmaci-oncologia.

Materiali e metodi

Abbiamo effettuato una ricerca nel database PubMed utilizzando i seguenti termini chiave: “acetogenine e cancro”, “attività antitumorale delle acetogenine”, “citotossicità delle acetogenine” e “meccanismo d’azione delle acetogenine”, tra le altre combinazioni. Abbiamo esaminato gli articoli pubblicati negli ultimi 15 anni che si basavano su due criteri: piante con uso medicinale e la metodologia di frazionamento guidata dal biodosaggio. I dati in vitro qui riportati si basano esclusivamente sull’attività dei composti puri, mentre per gli studi in vivo, sono stati considerati anche gli estratti di erbe a causa della mancanza di saggi in modelli animali.

Risultati e discussione

Studi in vitro

Nel campo dei prodotti naturali, la ricerca di molecole bioattive tende a coinvolgere un frazionamento degli estratti guidato dal test biologico per trovare la molecola o le molecole principali responsabili dell’attività. Tuttavia, molti metaboliti secondari possono colpire più caratteristiche del cancro. In generale, l’industria farmaceutica è interessata a farmaci che mostrano più di un’interazione molecolare e comprendono vari obiettivi molecolari.

Le acetogenine sono molecole con un grande potenziale per la futura terapia del cancro. La loro attività biologica più importante è l’inibizione del complesso mitocondriale I a causa della loro struttura bis-THF. Infatti, è stato precedentemente segnalato che gli AA mono-THF con una catena alchilica che collega la parte lattonica con il gruppo THF sono inibitori non competitivi del Complesso I (cioè, NADH: ubichinone ossidoreduttasi) nella catena respiratoria, che porta ad un blocco dell’ossidazione fosforilativa e una conseguente diminuzione della produzione di ATP (Tormo et al., 1999; Chen et al., 2012). Tale inibizione coinvolge un ampio gruppo di vie che possono indurre la morte cellulare, tra cui l’apoptosi e l’autofagia, o agire in altre reti metaboliche come inibitori dell’enzima lattato deidrogenasi A, come antiossidante, o arrestando il ciclo cellulare.

Inoltre, A. muricata (Moghadamtousi et al, 2015a) e A. squamosa L. (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b; Chen et al., 2012c; Chen et al., 2016) sono stati riportati per avere attività citotossica contro diverse linee cellulari di cancro umano o di altri mammiferi. In particolare, gli AAs annosquatins A (1) e B (2) mostrano selettività verso le linee cellulari MCF-7 e A-549, rispettivamente (Chen et al., 2012c). La tabella 1 mostra gli AA scoperti più recentemente che mostrano attività citotossica, oltre ad altri composti meno recenti che mostrano attività antineoplastica in vivo (tabella 2).

L’apoptosi è una strategia naturale di morte cellulare che uccide le cellule inutili o danneggiate. I principali geni coinvolti in questo processo sono p53 e la famiglia bcl2; il primo è un soppressore tumorale, mentre il secondo potrebbe essere sia proapoptotico (BAD, BAX e BAK tra gli altri) o antiapoptotico (bcl2, e bcl-x) (Okada e Mak, 2004). La funzione primaria di p53 è di prevenire la replicazione delle cellule con danni al DNA. Pertanto, p53 è inattiva, e le cellule danneggiate continuano a crescere e a replicare mutazioni del DNA, dando luogo a malattie come il cancro (Igney e Krammer, 2002; Okada e Mak, 2004). Così, la ricerca condotta fino ad oggi può essere classificata in due temi principali: induzione dell’apoptosi o meccanismi di resistenza all’apoptosi.

Le attuali chemioterapie che inducono l’apoptosi causano gravi effetti secondari sui pazienti. Come tale, la ricerca di farmaci meno tossici è una priorità e ci si aspetta che i prodotti naturali aiutino lo sviluppo di farmaci che modulano l’apoptosi. In questo contesto, gli AA aumentano l’attività delle caspasi 3 e 8 (effettori dell’apoptosi), mentre diminuiscono l’espressione di survivin e Bcl-2, aumentando così l’apoptosi. L’annonacina AA (3) promuove l’apoptosi nelle cellule tumorali attivando le vie della caspasi 3 e Bax (Yuan et al., 2003), mentre la squamocina induce l’apoptosi attraverso l’espressione dei geni proapoptotici Bax e Bad, che risulta nella scissione della PARP e nell’aumento dell’attività della caspasi 3 nelle cellule tumorali della vescica T24 (Yuan et al., 2006). Questo contrasta con i risultati precedenti in cui la squamocina non induceva l’apoptosi nelle cellule del cancro al seno ma inibiva la proliferazione bloccando il ciclo cellulare nella fase G1 (Raynaud et al., 1999).

L’estratto metanolico di A. reticulata inibisce l’espressione delle caspasi 6 e 9 nelle cellule del cancro al colon e al fegato (Mondal et al., 2007), mentre gli estratti organici e acquosi di A. squamosa down-regolano l’espressione di Bcl-2 nelle cellule di cancro al seno MCF-7 e nelle cellule leucemiche K-562, indicando il loro effetto come induttori di apoptosi (Pardhasaradhi et al., 2005). Inoltre, l’estratto di foglie di A. muricata induce l’espressione delle caspasi 3 e 9 e inibisce la proliferazione cellulare riducendo la fosfo-ERK e la fosfo-AKT nelle cellule MIA PaCa-2 (Yiallouris et al., 2018).

Gli AAs portano anche all’arresto del ciclo, che ha implicazioni sulla proliferazione delle cellule tumorali. Gli AA regolano il ciclo cellulare nella transizione G1/S inibendo l’espressione della ciclina D1 nelle cellule di carcinoma epatocellulare umano (Qian et al., 2015). In questo contesto, l’estratto di A. muricata arresta il ciclo cellulare nella fase G1 e diminuisce il numero di cellule nella fase S in modo concentrazione-dipendente riducendo l’espressione della ciclina D1, un’importante proteina di regolazione del ciclo cellulare (Torres et al., 2012). Un risultato simile è stato osservato per la squamocina, che arresta le cellule nella fase G1 nelle cellule di cancro alla vescica T24 (Yuan et al., 2006). Nonostante la rilevanza del ciclo cellulare, pochi studi hanno affrontato come gli AA influenzano questo meccanismo.

La glicolisi aerobica, un meccanismo utilizzato dalle cellule tumorali per ottenere energia in assenza di ossigeno (Figueroa-González et al., 2016; García-Castillo et al., 2017), è anche un obiettivo degli AA. Varie proteine ed enzimi glicolitici sono upregolati da HIF-1, un importante fattore di trascrizione coinvolto nella glicolisi aerobica tumorale, nelle cellule tumorali. È interessante notare che l’estratto di A. muricata ha abbassato l’espressione di HIF-1α e NF-κB e i livelli del trasportatore di glucosio GLUT1 e degli enzimi HKII e LDHA nelle cellule tumorali pancreatiche (Torres et al., 2012). Inoltre, l’estratto di foglie di A. muricata ha mostrato effetti antiproliferativi in linee cellulari di cancro e ha promosso la morte cellulare attraverso l’inibizione delle pompe NKA e SERCA (Yiallouris et al, 2018).

D’altra parte, il gene MDR1 codifica la glicoproteina P della membrana cellulare, una proteina trasportatrice chiave che estrude i farmaci anticancro dall’interno delle cellule, limitando così il loro accumulo intracellulare e diminuendo la loro tossicità (Figueroa-González et al., 2012). I metaboliti secondari, come flavonoli, ginsenosidi, polifenoli, alcaloidi e glicosidi resinosi, hanno mostrato risultati interessanti nella modulazione della P-gp nelle linee cellulari tumorali (Phang et al., 1993; Beck et al., 1988; Silva et al., 2001; Jodoin et al., 2002; Zhou et al., 2004; Figueroa-González et al., 2012). Inoltre, gli AA possono down-regolare l’espressione dei geni MDR1 e MRP1 nel carcinoma epatocellulare umano resistente ai farmaci, così come l’espressione della topoisomerasi IIα e della glutatione S-transferasiΠ (Qian et al., 2015).

Di recente, l’autofagia aveva generato interesse come meccanismo di morte cellulare. L’autofagia è un processo catabolico che le cellule eucariotiche attivano quando sono sotto stress, come l’inedia cellulare o la presenza di agenti patogeni (He e Klionsky, 2009). Durante questo processo, la cellula ricicla proteine o organelli non funzionali in un processo a più fasi che coinvolge la degradazione lisosomiale per recuperare infine l’omeostasi cellulare (Kenific e Debnath, 2015). Come tale, la deregolazione del flusso di autofagia potrebbe portare al cancro, poiché il riciclaggio di macromolecole, organelli non funzionali e proteine fornisce alle cellule tumorali un elevato fabbisogno metabolico per la proliferazione cellulare (Kenific e Debnath, 2015; García-Castillo et al., 2017). In questo scenario, l’autofagia è diventata un interessante bersaglio terapeutico, e gli AA potrebbero essere in grado di inibire questo processo. Liu et al. (2012) hanno riferito che il composto AA005 (un analogo dell’acetogenina) ha inibito la produzione di ATP, attivato AMPK e bloccato la via del complesso mTOR 1 per indurre infine l’autofagia nelle cellule del cancro del colon e arrestare il ciclo cellulare nella fase G1. Questo composto è un mimico degli AA, in cui un’unità etere di glicole etilenico sostituisce i due anelli THF. Tale modalità chimica conferisce un’attività biologica superiore, un esempio della plasticità degli AA da considerare come ispirazione per creare nuove e più potenti molecole con diversi obiettivi farmacologici.

Attività antitumorale delle acetogenine in modelli animali

I dati riguardanti l’attività antitumorale degli AA e degli estratti di Annona sono particolarmente promettenti poiché questi composti hanno mostrato attività antitumorale in modelli animali. Gli studi in vivo forniscono informazioni chiave sulle prestazioni del farmaco in un intero organismo e permettono di valutare non solo il loro effetto antitumorale ma anche la loro tossicità in diversi organi. È importante sottolineare che gli animali sono soggetti sperimentali che permettono di eseguire il follow-up clinico, compresa la valutazione del risultato clinico, la progressione libera da malattia e la sopravvivenza, e la recidiva della malattia.

L’estratto etilico acetato di A. squamosa che è ricco di AAs 12,15-cis-squamostatina-A (4) e bullatacina (5) ha ridotto la crescita tumorale dei tumori epatocellulari nei topi con un tasso inibitorio massimo del 69,55% rispetto al controllo positivo (ciclofosfamide) (Chen et al., 2012b). È stato suggerito che la configurazione cis in uno dei componenti potrebbe essere responsabile dell’attività citotossica della preparazione a base di erbe. Inoltre, la bullatacina (5) isolata da A. squamosa alla dose di 15 μg/kg ha ridotto efficacemente la crescita del tumore nei topi con xenotrapianti S180 e HepS del 65,8 e 63,4%, rispettivamente. Questi risultati sono superiori a quelli ottenuti utilizzando concentrazioni più elevate di taxolo (40 μg/kg). La bullatacina (5) possiede una moiety bis-THF adiacente e tre gruppi idrossi, che probabilmente costituiscono la struttura bioattiva (Chen et al., 2012a).

L’olio di semi di A. squamosa ha inibito il 53,54% della crescita tumorale in topi portatori di cellule H22 (Chen et al., 2016) e ha ridotto l’espressione di IL-6, Jak, e vari trasduttori di segnale fosforilati e attivatori della trascrizione p-Stat3 pathway. È stato anche riportato che le α, β-insature γ-lattone moieties presenti negli AAs sono accettori di reazione Michael (Ji et al., 2012), che inibiscono l’attivazione di Stat3, un bersaglio terapeutico coinvolto nella proliferazione cellulare, apoptosi, infiammazione e angiogenesi (Cafferkey e Chau, 2016). L’estratto di A. muricata ha rallentato la crescita tumorale in xenotrapianti di pancreas (Yiallouris et al., 2018), riducendo le metastasi diminuendo i livelli della metalloproteinasi-9, e promuovendo la morte delle cellule tumorali attraverso la necrosi (Torres et al., 2012). In uno xenotrapianto di prostata, l’estratto di A. muricata arricchito di flavonoidi ha migliorato la biodisponibilità e ha mostrato una minore tossicità rispetto all’estratto arricchito di AA (Yang et al., 2015).

Laherradurin (6) e cherimolin-2 (7) sono stati isolati dalla pianta medicinale A. diversifolia e testati in vivo contro cellule tumorali cervicali e colorettali (Schlie-Guzmán et al., 2009). Entrambi gli AA hanno ridotto le dimensioni dei tumori HeLa con valori simili a quelli della doxorubicina; entrambi i composti hanno anche mostrato un’attività antiproliferativa in vitro contro la stessa linea cellulare tumorale. Questi risultati sono in accordo con altri rapporti, dove la molecola più attiva è stata riportata essere laherradurin (6), che possiede adiacenti bis-THF moieties e una struttura β-idrossi γ-metil γ-lattone, mentre cherimolin-2 (7) che contiene una non adiacente bis-THF moiety e una unità γ-lattone mostra una ridotta attività antitumorale. La tabella 2 delinea le attività antitumorali di vari AA in modelli animali.

Studi di tossicità

Gli esperimenti con gli animali dovrebbero includere protocolli di tossicità orale acuta per testare le sostanze chimiche e osservare i segni di tossicità; questi minimizzano il numero di animali necessari, assicurano una corretta somministrazione della dose negli esperimenti, ed evitano la sofferenza (OECD, 2008). Tuttavia, ad oggi, ci sono poche informazioni sulla tossicità degli AA o degli estratti di Annona. Per esempio, la DL50 per l’estratto etanolico di A. muricata nei topi era di 1,67 g/kg secondo Sousa et al. (2010). Arthur et al. (2011) hanno riportato la LD50 (<5 g/kg) dell’estratto acquoso, registrando che una dose maggiore potrebbe danneggiare i reni. Inoltre, è stato osservato che l’estratto di semi di A. squamosa potrebbe causare danni al fegato (Miao et al., 2016b), e l’estratto di A. muricata arricchito di flavonoidi ha mostrato una ridotta tossicità in uno xenotrapianto di prostata (Yang et al., 2015). La cherimolina-2 isolata da A. diversifolia ha mostrato effetti tossici e morte in xenotrapianti SW480 a dosi superiori a 5 mg/kg/giorno (Schlie-Guzmán et al., 2009).

Come spiegato prima, gli AA possono inibire il complesso 1 della catena respiratoria attraverso il trasporto della catena degli elettroni nei mitocondri. Gli AA si uniscono e bloccano l’enzima NADH, che di solito è sovraespresso nelle cellule tumorali, inibendo la produzione di ATP, portando infine alla morte cellulare. Presumibilmente, tale meccanismo suggerisce che gli AA sono “innocui” per le cellule normali; tuttavia, dovrebbero essere eseguiti più studi per assicurare la selettività di queste molecole.

Conclusione

La chemioterapia non è specifica per le cellule tumorali; essa causa diversi effetti collaterali indesiderati come danni ai tessuti e organi normali. Tuttavia, l’aspetto più importante della chemioterapia convenzionale è che in un numero significativo di casi, le cellule tumorali sviluppano meccanismi di resistenza che permettono la progressione del tumore e le metastasi.

La ricerca di nuovi farmaci in natura non è nuova. Diversi derivati di sostanze naturali sono attualmente utilizzati per trattare diverse malattie. Per esempio, il taxolo (paclitaxel) che è stato scoperto dalla conoscenza tradizionale è considerato il trattamento del cancro più redditizio sul mercato. È interessante notare che il paclitaxel è un farmaco antimitotico che inibisce la proliferazione cellulare nelle colture cellulari ma, nei tumori, è stato documentato che induce divisioni multipolari, il che descrive come una molecola può avere diversi meccanismi di azione a seconda delle condizioni in vitro o del paziente. Questo alcaloide ha 30 anni di storia e illustra i principali ostacoli del lavoro con i prodotti naturali, la loro limitata disponibilità biologica e i costi di produzione, ma anche l’incredibile efficacia nell’uccidere le cellule tumorali.

Le acetogenine sono molecole anticancro versatili che causano la morte delle cellule tumorali con diversi meccanismi. Possono modulare l’esclusione dei farmaci chemioterapici dalle cellule tumorali e sono forti induttori di apoptosi. La loro flessibilità bioattiva si riflette nella loro capacità di regolare il ciclo cellulare arrestando le cellule in fase G1, promuovendo l’apoptosi attraverso l’inibizione di varie proteine, e anche di indurre l’autofagia. Inoltre, spiccano le loro interazioni metaboliche, specificamente legate ai fattori di trascrizione HIF1 e STAT3 e le sue ripercussioni sul consumo energetico, l’angiogenesi, l’infiammazione e le metastasi. L’attività antitumorale degli AA in vivo è promettente (bullatacina, laherradurin e cherimolin-2 sono esempi). Tuttavia, i dati preclinici non sono sufficienti per ottenere una buona comprensione della farmacodinamica e della cinetica degli AA, e sono necessari più test di tossicità acuta e di solubilità per assicurare la sicurezza e la possibilità di test clinici con gli esseri umani. Inoltre, l’incorporazione di diversi ligandi (ad esempio, anticorpi, vitamine e peptidi) o la preparazione di derivati specifici per il tumore potrebbero migliorare l’attività degli AA e produrre farmaci più adatti.

Gli estratti di piante sono chimicamente complessi, e le loro proprietà curative spesso dipendono dalle interazioni tra i composti e dalle loro proporzioni all’interno dell’estratto. C’è ancora molto da scoprire sull’impatto degli AA nel cancro. Questo campo offre l’opportunità di trovare nuove molecole per il trattamento di questa complessa malattia. La standardizzazione degli estratti è, quindi, una possibile alternativa all’uso di integratori a base di erbe, soprattutto nelle piante in cui le attività farmacologiche sono basate sulla combinazione di più di un composto. Questa mini-review elenca alcuni AA precedentemente studiati che presentano attività antitumorale e potrebbero avere un futuro nella ricerca clinica sul cancro.

Contributi degli autori

NJ-H ha contribuito all’ideazione, alla scrittura e alla discussione dell’articolo; CP-P ha contribuito sostanzialmente alla discussione e alla revisione del manoscritto; VC-T ha preparato tutte le figure e le tabelle; MM-V e AG-E hanno contribuito alla sezione chimica dell’articolo; AZ-D ha contribuito notevolmente alla discussione di biologia molecolare dell’articolo. Tutti gli autori hanno discusso, rivisto e approvato la versione finale del manoscritto da pubblicare.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Messico (borsa numero 285884). VC-T è stato finanziato da CONACYT (borsa di studio numero 267787).

Conflict of Interest Statement

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

NJ-H ringrazia CONACYT per il finanziamento del progetto.