Proteina espressione, purificazione e procedure di saggio di hAASS-SDH
Vettore: pFB-LIC-Bse
Linea cellulare: DH10Bac
Tags e aggiunte: N-terminale, tag esaistidina scindibile dalla proteasi TEV
Costruisci la sequenza della proteina:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(la sequenza sottolineata contiene il tag His-e il sito di scissione della proteasi TEV*)
Le cellule raccolte sono state risospese in un tampone di lisi (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerolo, 20 mM Imidazolo pH 7.4, 0.5 mM TCEP, 1 µL per 1 mL di cocktail inibitore di proteasi senza EDTA).
Il pellet di cellule è stato dissolto in circa 200 mL di tampone di lisi e rotto mediante omogeneizzazione con 2 passaggi a 12.000 psi. I detriti cellulari sono stati pellettizzati a 35000 x g, 1h e il surnatante utilizzato per la purificazione su una colonna Ni-NTA a flusso di gravità (5 mL).
I tamponi utilizzati sono dettagliati qui di seguito;
Binding Buffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerolo, 20 mM Imidazolo pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Tampone di lavaggio: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% glicerolo, 40 mM Imidazolo pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Tampone di eluizione: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerolo, 250 mM Imidazolo pH 7.4, 0.5 mM TCEP
L’estratto cellulare chiarificato è stato aggiunto a 5 ml di resina Ni-NTA pre-equilibrata con tampone di lisi e passata attraverso una colonna di vetro. La colonna è stata poi lavata con Binding Buffer (2 x 50 mL) e Wash Buffer (2 x 50 mL). La proteina è stata eluita con Elution Buffer in 5 x 5 mL di frazioni. Le frazioni eluite dalla colonna 1 sono state raggruppate e concentrate a 5 mL con un concentratore di spin da 30 kDa MWCO e iniettate in una colonna S200 16/60 (pre-equilibrata in GF Buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 5% Glycerol)) a 1.0 mL/min. Sono state raccolte frazioni da 1,5 mL. La proteina eluita è stata scissa durante la notte a 4 °C dalla proteasi TEV (1/20 (w/w)). Il giorno seguente il campione proteico è stato caricato su 0,5 ml di colonna Ni-sepharose pre-equilibrata con GF buffer per rimuovere la proteina non scissa. Le frazioni proteiche raggruppate sono state concentrate a 13 mg/mL usando un concentratore mwco da 30 kDa.
Saggio di attività e screening
L’attività SDH di hAASS è stata misurata seguendo la riduzione di NAD+ a NADH, sfruttando il fatto che la forma ridotta di NADH è fluorescente quando eccitata con luce a 340 nm. Abbiamo adottato il saggio in formato 384 pozzetti, con rilevamento utilizzando il lettore di fluorescenza PheraStar (BMG Labtech) (eccitazione/emissione = 340/480 nm). Questo saggio ha dato una risposta lineare con concentrazione di proteine fino a 150 nM. Una tipica reazione consiste in 100 nM di enzima purificato, 0,2 mM di NAD+, 1,3 mM di saccaropina. Il buffer di reazione consiste in 25 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS. Le librerie di composti (LOPAC (Sigma) e NIH Clinical Collections I&II) sono state vagliate in-house a 20 μM di concentrazione del composto.
Fluorimetria a scansione differenziale
DSF è stata eseguita in una piastra a 96 pozzetti utilizzando una macchina RT-PCR Mx3005p (Stratagene) con filtri di eccitazione ed emissione di 492 e 610 nm, rispettivamente. Ogni pozzetto consisteva di 2 µL di proteina in 2 µM di tampone DSF (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.5), 2 µL di SYPRO ORANGE diluito 1000 volte in tampone DSF dal magazzino del produttore (Invitrogen), e (se applicabile) 2 µL di ligando a varie concentrazioni. Le intensità di fluorescenza sono state misurate da 25 a 96°C con una velocità di rampa di 3°C/min.
Cristallizzazione
I cristalli di Apo sono stati preparati mescolando 50 nL di proteina hAASS-SDH (80 mg/mL) con 100 nL di soluzione serbatoio contenente 20% PEG3350, 0.1M Tris pH 7.5 e 0.2-0.33 M sodio malonato. NAD + cristalli legati sono stati preparati mescolando 100 nL di hAASS-SDH (18 mg/mL, in eccesso molare di NAD +) con 50 nL di soluzione serbatoio contenente 25% PEG3350, 0,2 M NaCl e 0,1 M tris pH 8,5. I cristalli sono stati crioprotetti in 9% butandiolo prima del congelamento in azoto liquido. Per la campagna di screening dei frammenti, i cristalli sono stati impregnati di composti (10/50/500 mM) nella soluzione di cristallizzazione integrata con 8% butandiolo per 5-30 min, e congelati in azoto liquido.
Procedure di determinazione della struttura
I cristalli di hAASS-SDH apo e NAD+-bound appartengono a diversi spacegroups (P43212 vs P212121). La struttura di hAASS-SDH è stata risolta per sostituzione molecolare con il programma PHASER, utilizzando la saccaropina reduttasi fungina di S.cerevisiae (codice PDB 2AXQ) come modello di ricerca (38% di identità di sequenza). Sono state trovate due molecole nell’unità asimmetrica (a.u.). Il modello iniziale è stato ricostruito utilizzando phenix.autobuild. Una molecola di NAD+ legata nel sito attivo è stata identificata con il metodo della differenza di Fourier e collocata manualmente nella densità elettronica usando Coot. Per completare il modello sono stati eseguiti cicli iterativi di phenix.refinement compreso il raffinamento TLS seguito dalla costruzione manuale del modello per i residui mancanti utilizzando Coot. Nessun vincolo NCS è stato applicato a causa delle differenze conformazionali nel dominio III (res 278-376) delle due copie in a.u. Gli atomi di solvente sono stati posizionati durante gli ultimi quattro cicli di raffinamento utilizzando phenix.refine. Per la campagna di screening dei frammenti, i ligandi sono stati identificati da DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) usando mappe di densità di differenza. I leganti più deboli con bassa occupazione sono stati valutati utilizzando PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), basato su modelli statistici per trovare la densità del legante presente in un dato set di dati che non è presente nella maggioranza dei set di dati. Le coordinate e i fattori di struttura per tutti i set di dati sono depositati nella RCSB Protein Data Bank. Le statistiche di raccolta e raffinamento dei dati sono disponibili dalle pagine del PDB.
Reagenti disponibili in commercio
CRISPR/Cas9 plasmidi knockout
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157