Il coronavirus 2019 (COVID-19) è una malattia infettiva che ha causato una pandemia globale con più di 36 milioni di persone infette da circa 200 paesi o territori, con più di 1 milione di morti fino ad oggi (Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), 2020). L’agente causale della COVID-19, il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), si presume sia originato dai pipistrelli, poiché il coronavirus RaTG13 trasmesso dai pipistrelli è il parente genetico più vicino fino ad oggi (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Diverse specie sono state studiate per determinare il loro ruolo potenziale come ospiti intermedi (Shi et al., 2020). Inoltre, i modelli animali per ricapitolare una malattia simile alla COVID-19 sono considerati una linea di ricerca importante e necessaria per lo sviluppo di farmaci terapeutici e composti profilattici.
Oltre a diversi studi di modellazione che propongono potenziali specie animali suscettibili alla SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), molteplici infezioni sperimentali hanno già mostrato una vasta gamma di animali suscettibili. In particolare, il pipistrello della frutta egiziano, il furetto, il criceto siriano dorato, il gatto, i topi che esprimono l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 umanizzato (ACE2), i topi BALB/c (utilizzando un SARS-CoV-2 mutato da diversi passaggi di coltura cellulare) e alcune specie di primati non umani sono permissivi all’infezione virale, sviluppando da subclinica a malattia respiratoria lieve-moderata (Bao et al., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Da un punto di vista sperimentale, la suscettibilità del cane alla SARS-CoV-2 è limitata, poiché gli animali inoculati possono in parte sieroconvertirsi (Shi et al., 2020). Al contrario, l’inoculazione intranasale di pollo, anatra e maiale non ha portato a nessuna evidenza di infezione (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Il maiale è comunemente usato nella ricerca a causa delle somiglianze esistenti con l’uomo in termini di anatomia, genetica, fisiologia e, anche, immunologia. Infatti, gli esperimenti nei maiali sono probabilmente più predittivi dei trattamenti terapeutici e preventivi negli esseri umani rispetto agli esperimenti nei roditori (Meurens et al., 2012). Tuttavia, poiché i maiali non sono suscettibili all’infezione da SARS-CoV-2 quando vengono inoculati per via intranasale (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), la possibilità di sviluppare un modello di infezione suina con questo virus utilizzando altre potenziali vie di inoculazione merita un’indagine. Il principale razionale per testare i maiali è che il recettore ACE2 di questa specie è funzionale sia trasfettando ACE2 suina in cellule HeLa (che non esprimono costitutivamente l’ACE2 umana) (Zhou et al., 2020) o che le pseudoparticelle con la proteina S di SARS-CoV-2 sono in grado di infettare cellule renali suine (Letko et al., 2020). Inoltre, la proteina ACE2 è espressa in tutti i principali tessuti dei suini, come valutato dall’immunoistochimica (Xiao et al., 2020). Di conseguenza, per creare un modello putativo di maiale COVID-19, abbiamo studiato l’effetto di diverse vie naturali e non naturali di inoculazione della SARS-CoV-2 nei maiali domestici (Sus scrofa domesticus).
A questo scopo, quattro gruppi di cinque suinetti convenzionali di 5-6 settimane (Landrace × Large White) sono stati selezionati e inoculati per mezzo di diverse vie: intranasale (IN, 1,5 ml/nostril; volume totale di 3 ml), intratracheale (IT, 3 ml) come precedentemente descritto (Garcia-Morante et al, 2016), intramuscolare (IM, 1 ml in ciascun lato dei muscoli del collo; volume totale 2 ml) o endovenosa (IV, 2 ml), con una dose finale di 105,8 dosi infettive da coltura di tessuti (TCID50) dell’isolato SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) per ciascun animale. I gruppi IT e IV sono stati anestetizzati con 10 mg/kg di ketamina e 0,8 mg/kg di xilazina prima dell’inoculazione. Un passaggio-2 SARS-CoV-2 è stato propagato e titolato in cellule Vero E6 (ATCC CRL-1586), seguendo lo stesso protocollo utilizzato per altri coronavirus (Rodon et al., 2019). Due maiali in più sono stati utilizzati come controlli negativi.
Tutti gli animali erano sieropositivi contro il coronavirus respiratorio suino, come determinato da un ELISA commerciale (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Tenendo conto che nessuna cross-reattività anticorpale tra alfa e beta-coronavirus è stato descritto (Okba et al., 2020), gli animali sono stati tenuti nello studio. La reattività iniziale contro il PRCV era attesa poiché questo virus è ubiquitario nel bestiame suino europeo (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per il benessere degli animali dell’Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) e dalla Commissione etica della sperimentazione animale del governo autonomo della Catalogna e condotti da personale certificato. Gli esperimenti con SARS-CoV-2 sono stati eseguiti presso le strutture di Biosafety Level-3 (BSL-3) dell’Unità di Biocontenimento dell’IRTA-CReSA (Barcellona, Spagna).
A 2 e 22 giorni dopo l’inoculazione (dpi), due e tre animali/gruppo (IT, IM e IV), rispettivamente, sono stati sottoposti a eutanasia. Poiché l’inoculazione IN è già stata dimostrata come non efficace per causare l’infezione da SARS-CoV-2 (Shi et al., 2020), i maiali inoculati per questa via sono stati sottoposti a eutanasia nei giorni 1 e 2 pi per valutare l’evidenza di una possibile infezione transitoria iniziale nei tessuti. Gli animali di controllo negativi sono stati eutanasizzati prima dell’inizio dell’esperimento. I campioni sono stati raccolti ed elaborati come precedentemente descritto (Vergara-Alert et al., 2017). Brevemente, necroscopie complete sono state eseguite in tutti gli animali. Diversi tessuti (turbinati frontali, mediali e caudali; trachea prossimale, mediale e distale; bronco grande e piccolo, aree polmonari craniali, mediodorsali e caudali sinistre; rene; fegato; cuore e milza) sono stati prelevati, fissati per immersione in formalina tamponata neutra al 10%, incorporati in paraffina e sezionati a 3 µm per preparare vetrini. I vetrini istologici sono stati colorati con ematossilina ed eosina (HE) per valutare potenziali lesioni microscopiche. Inoltre, gli stessi tessuti più ileo, linfonodo cervicale (LN), LN mediastinico, LN mesenterico, bulbo olfattivo, tonsilla, timo, ghiandola salivare parotidea, surrene, pancreas, tronco encefalico, palpebre e midollo osseo sono stati prelevati in provette con perline in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) per eseguire il rilevamento del gene SARS-CoV-2 upE mediante RT-qPCR (Corman et al., 2020). Sono stati anche prelevati tamponi nasali e rettali (quotidianamente durante la prima settimana e a 14 e 22 dpi) per analizzarli per la presenza di RNA virale mediante la suddetta RT-qPCR. I campioni di siero raccolti nei giorni 0, 14 e 22 pi sono stati testati per la presenza di anticorpi contro le proteine S1 + S2 e del nucleocapside (N) della SARS-CoV-2 spike mediante ELISA interni (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Inoltre, un test di neutralizzazione del virus è stato eseguito seguendo un protocollo precedente con una piccola modifica (Rodon et al., 2020), le diluizioni seriali di sieri e SARS-CoV-2 sono state incubate per 1 ora a 37°C prima dell’esecuzione del test su piastra.
Tutti gli animali sono stati monitorati quotidianamente, ma nessuno di loro ha mostrato segni clinici dopo l’inoculazione della SARS-CoV-2. Inoltre, nessuna lesione grossolana o microscopica attribuibile all’infezione da SARS-CoV-2 è stata trovata in nessuno degli animali studiati di tutti i gruppi di inoculazione e di quelli di controllo (dati non mostrati).
Nessuno dei maiali ha avuto uno spargimento nasale o rettale di RNA virale. La trachea prossimale di un animale inoculato con IN era positiva a 1 dpi per l’RNA virale (Cq = 24,36). I tessuti rimanenti da questo animale e il resto dei suini sono risultati negativi per RT-qPCR (limite di rilevamento qPCR di 38.6 cicli).
Per 14 e 22 dpi, bassi livelli di anticorpi diretti contro la proteina Spike potrebbe essere rilevato in tutti gli animali da IM e IV gruppi (Figura 1a). Inoltre, questi maiali hanno anche mostrato titoli anticorpali neutralizzanti a 22 dpi (che vanno da 74 a 317 SNT50 titolo di diluizione reciproca) (Figura 1b). Inoltre, bassi livelli di anticorpi che mirano alla proteina N sono stati trovati in uno dei tre IM e in tutti gli animali inoculati in IV alla fine dell’esperimento (dati non mostrati). È importante notare che un singolo animale del gruppo IT non ha mostrato anticorpi contro la S ma aveva anticorpi contro la proteina N, nonché titoli neutralizzanti (SNT50 reciproca diluizione titolo di 29) al giorno 0 pi, che potrebbe suggerire una potenziale reazione incrociata con un altro coronavirus infetta suini. Da notare che questi anticorpi contro la proteina N sono diminuiti al termine dell’esperimento, suggerendo che fossero di origine materna. Inoltre, questo animale non ha mostrato anticorpi seroneutralizzanti al 22 dpi (Figura 1b).
I dati attuali indicano che la SARS-CoV-2 non è stata in grado di infettare i suini attraverso nessuna delle vie testate, cioè IN, IT, IM e IV. Pertanto, i nostri sforzi confermano gli esperimenti precedenti che indicano la mancanza di suscettibilità di infezione da parte del maiale (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), anche se può essere utilizzato per valutare l’immunogenicità dei prossimi candidati vaccinali.
Importante, lo studio attuale va oltre altri studi con SARS-CoV-2 e i maiali poiché abbiamo testato un numero più ampio di vie di inoculazione. Tuttavia, nessuna di esse ha portato a un’infezione produttiva nei suinetti. Un risultato significativo di questo studio è stata l’evidenza della sieroconversione contro la glicoproteina Spike al 14° e 22° giorno di vita e la presenza di anticorpi neutralizzanti al 22° giorno di vita nei suini inoculati per via parenterale (IM e IV). Considerando la breve durata dell’esperimento (22 giorni), tale sieroconversione sottolinea il potenziale interesse del maiale per essere utilizzato negli studi di immunogenicità per la SARS-CoV-2. Infatti, l’interesse del maiale come modello animale adatto per l’immunologia, così come la fisiologia, la farmacologia e la chirurgia, applicabile alla medicina umana è ampiamente riconosciuto (Rothkötter, 2009).
In conclusione, il presente studio conferma che i suinetti non sono un modello animale adatto per COVID-19, ma la sua potenziale utilità come modello per l’immunogenicità negli studi preclinici di sviluppo del vaccino merita ulteriori indagini.