Il pirosequenziamento è un metodo di sequenziamento del DNA (determinazione dell’ordine dei nucleotidi nel DNA) basato sul principio del “sequenziamento per sintesi”, in cui il sequenziamento viene eseguito rilevando il nucleotide incorporato da una DNA polimerasi. Il pirosequenziamento si basa sulla rilevazione della luce basata su una reazione a catena quando il pirofosfato viene rilasciato. Da qui, il nome pirosequenziamento.
Il principio del pirosequenziamento è stato descritto per la prima volta nel 1993 da Bertil Pettersson, Mathias Uhlen e Pål Nyren combinando il metodo di sequenziamento in fase solida usando perline magnetiche rivestite di streptavidina con una DNA polimerasi ricombinante priva di attività da 3 a 5 esonucleasi (proof-reading) e la rilevazione della luminescenza usando l’enzima lucciola luciferasi. Una miscela di tre enzimi (DNA polimerasi, ATP solforilasi e lucciola luciferasi) e un nucleotide (dNTP) sono aggiunti al DNA a singolo filamento da sequenziare e l’incorporazione del nucleotide è seguita dalla misurazione della luce emessa. L’intensità della luce determina se sono stati incorporati 0, 1 o più nucleotidi, mostrando così quanti nucleotidi complementari sono presenti sul filamento modello. La miscela di nucleotidi viene rimossa prima di aggiungere la successiva miscela di nucleotidi. Questo processo viene ripetuto con ciascuno dei quattro nucleotidi fino a quando la sequenza del DNA del template a singolo filamento è determinata.
Un secondo metodo basato sulla soluzione per il pirosequenziamento è stato descritto nel 1998 da Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen e Pål Nyren. In questo metodo alternativo, viene introdotto un ulteriore enzima apirasi per rimuovere i nucleotidi che non vengono incorporati dalla DNA polimerasi. In questo modo la miscela enzimatica che include la DNA polimerasi, la luciferasi e l’apirasi può essere aggiunta all’inizio e mantenuta per tutta la procedura, fornendo così un semplice set-up adatto all’automazione. Uno strumento automatizzato basato su questo principio è stato introdotto sul mercato l’anno successivo dalla società Pyrosequencing.
Una terza variante microfluidica del metodo Pyrosequencing è stata descritta nel 2005 da Jonathan Rothberg e collaboratori della società 454 Life Sciences. Questo approccio alternativo per il pirosequenziamento era basato sul principio originale di attaccare il DNA da sequenziare a un supporto solido e hanno dimostrato che il sequenziamento poteva essere eseguito in modo altamente parallelo usando un microarray microfabbricato. Questo ha permesso un sequenziamento del DNA ad alta produttività e uno strumento automatizzato è stato introdotto sul mercato. Questo divenne il primo strumento di sequenziamento di nuova generazione, iniziando una nuova era nella ricerca genomica, con prezzi in rapido calo per il sequenziamento del DNA che permetteva il sequenziamento dell’intero genoma a prezzi accessibili.