L’obiettivo raccoglie un ventaglio di raggi da ogni punto dell’oggetto e immagina il fascio di raggi sul piano focale anteriore dell’oculare. Le regole convenzionali del ray tracing si applicano alla formazione dell’immagine. In assenza di aberrazioni, i raggi geometrici formano un’immagine puntiforme di ogni punto oggetto. In presenza di aberrazioni, ogni punto dell’oggetto è rappresentato da un punto indistinto. L’oculare è concepito per immaginare i raggi in un punto focale ad una distanza conveniente per la visualizzazione dell’immagine. In questo sistema, la luminosità dell’immagine è determinata dalle dimensioni delle aperture delle lenti e dall’apertura della pupilla dell’occhio. La lunghezza focale e il conseguente ingrandimento dell’obiettivo devono essere scelti per ottenere la risoluzione desiderata dell’oggetto ad una dimensione conveniente per la visualizzazione attraverso l’oculare. La formazione dell’immagine nel microscopio è complicata dalla diffrazione e dall’interferenza che hanno luogo nel sistema di imaging e dal requisito di usare una fonte di luce che viene ripresa nel piano focale.
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La moderna teoria della formazione dell’immagine al microscopio fu fondata nel 1873 dal fisico tedesco Ernst Abbe. Il punto di partenza della teoria di Abbe è che gli oggetti nel piano focale del microscopio sono illuminati dalla luce convergente di un condensatore. La luce convergente dalla sorgente può essere considerata come un insieme di molte onde piane che si propagano in una serie specifica di direzioni e si sovrappongono per formare l’illuminazione incidente. Ognuna di queste onde piane efficaci è diffratta dai dettagli nel piano dell’oggetto: più piccola è la struttura dettagliata dell’oggetto, più ampio è l’angolo di diffrazione.
La struttura dell’oggetto può essere rappresentata come una somma di componenti sinusoidali. La rapidità di variazione nello spazio delle componenti è definita dal periodo di ogni componente, o la distanza tra i picchi adiacenti nella funzione sinusoidale. La frequenza spaziale è il reciproco del periodo. Più fini sono i dettagli, più alta è la frequenza spaziale richiesta delle componenti che rappresentano il dettaglio dell’oggetto. Ogni componente di frequenza spaziale produce la diffrazione ad un angolo specifico che dipende dalla lunghezza d’onda della luce. Come esempio, le componenti di frequenza spaziale che hanno un periodo di 1 μm avrebbero una frequenza spaziale di 1.000 linee per millimetro. L’angolo di diffrazione di una tale componente per la luce visibile con una lunghezza d’onda di 550 nanometri (nm; 1 nanometro è 10-9 metri) sarà di 33,6°. L’obiettivo del microscopio raccoglie queste onde diffratte e le dirige verso un piano immagine, dove l’interferenza tra le onde diffratte produce un’immagine dell’oggetto.
Perché l’apertura dell’obiettivo è limitata, non tutte le onde diffratte dall’oggetto possono essere trasmesse dall’obiettivo. Abbe dimostrò che maggiore è il numero di onde diffratte che raggiungono l’obiettivo, più fine è il dettaglio che può essere ricostruito nell’immagine. Egli designò il termine apertura numerica (N.A.) come la misura della capacità dell’obiettivo di raccogliere la luce diffratta e quindi anche del suo potere di risolvere i dettagli. Su questa base è ovvio che maggiore è l’ingrandimento dell’obiettivo, maggiore è l’N.A. richiesto dell’obiettivo. Il più grande N.A. teoricamente possibile in aria è 1.0, ma i vincoli di progettazione ottica limitano il N.A. che può essere raggiunto a circa 0.95 per gli obiettivi a secco.
Per l’esempio precedente di un campione con una frequenza spaziale di 1.000 linee per millimetro, il N.A. richiesto per raccogliere la luce diffratta sarebbe 0.55. Quindi, un obiettivo di 0,55 N.A. o superiore deve essere usato per osservare e raccogliere dati utili da un oggetto con dettagli distanziati di 1 μm. Se l’obiettivo ha un N.A. inferiore, i dettagli dell’oggetto non saranno risolti. I tentativi di ingrandire il dettaglio dell’immagine con l’uso di un oculare ad alta potenza non produrranno alcun aumento della risoluzione. Quest’ultima condizione è chiamata ingrandimento a vuoto.
La lunghezza d’onda della luce si accorcia quando si propaga attraverso un mezzo denso. Per risolvere i più piccoli dettagli possibili, gli obiettivi ad immersione sono in grado di raccogliere la luce diffratta da dettagli più fini rispetto agli obiettivi in aria. L’N.A. è moltiplicato per l’indice di rifrazione del mezzo, e sono possibili N.A. di lavoro di 1,4. Nei migliori microscopi ottici si possono osservare strutture con frequenza spaziale di 0,4 μm. Si noti che le singole lenti realizzate da Leeuwenhoek hanno dimostrato di essere in grado di risolvere fibrille di soli 0,7 μm di spessore.