L’interazione 4-1BB/4-1BBL promuove l’infiammazione adiposa indotta dall’obesità innescando una segnalazione infiammatoria bidirezionale negli adipociti/macrofagi

Abstract

L’infiammazione adiposa indotta dall’obesità è caratterizzata dal reclutamento di macrofagi nel tessuto adiposo e dal rilascio di citochine infiammatorie. 4-1BB, un recettore costimolatorio, modula i processi infiammatori attraverso l’interazione con il suo ligando 4-1BBL sulla superficie delle cellule immunitarie. In questo studio, abbiamo esaminato se un’interazione 4-1BB/4-1BBL tra adipociti e macrofagi partecipa all’infiammazione adiposa indotta dall’obesità. Abbiamo scoperto che il 4-1BB era espresso sugli adipociti ed è stato upregolato da fattori legati all’obesità, che hanno anche aumentato l’espressione del 4-1BBL sui macrofagi. Gli agonisti 4-1BB e/o 4-1BBL, rispettivamente, hanno attivato le molecole di segnalazione infiammatoria (MAPK/IκBα e MAPK/Akt) negli adipociti e nei macrofagi e hanno aumentato il rilascio di citochine infiammatorie (MCP-1, TNF-α e IL-6). Inoltre, l’interruzione dell’interazione 4-1BB/4-1BBL ha diminuito il rilascio di citochine infiammatorie da adipociti/macrofagi coltivati a contatto. Questi risultati indicano che la segnalazione bidirezionale mediata da 4-1BB/4-1BBL negli adipociti/macrofagi promuove l’infiammazione adiposa. 4-1BB e 4-1BBL possono essere obiettivi utili per la protezione contro l’infiammazione adiposa indotta dall’obesità.

1. Introduzione

L’infiammazione indotta dall’obesità è considerata una causa potenziale di disturbi metabolici come l’insulino-resistenza, il diabete di tipo 2 e le malattie cardiovascolari. Il tessuto adiposo partecipa attivamente all’infiammazione indotta dall’obesità attraverso il reclutamento di macrofagi e cellule T e il rilascio di citochine infiammatorie (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1; tumor necrosis factor alpha, TNF-α; interleuchina-6, IL-6) che modulano la differenziazione degli adipociti, il metabolismo e le risposte infiammatorie locali/sistemiche, causando squilibri metabolici indesiderati. È interessante notare che studi recenti hanno dimostrato che la cocoltura a contatto diretto di adipociti e macrofagi provoca un rilascio notevolmente elevato di citochine infiammatorie, indicando che l’interazione tra le molecole di superficie cellulare su queste cellule è importante per promuovere le loro risposte infiammatorie.

4-1BB (noto anche come CD137 e TNFRSF9) è un classico esempio di molecola costimolatoria e un noto recettore infiammatorio che viene espresso dalle cellule T attivate nei siti di infiammazione. La stimolazione di 4-1BB sulle cellule T porta all’espansione cellulare, alla produzione di citochine e allo sviluppo di funzioni effettrici citolitiche. Il ligando 4-1BB (4-1BBL, noto anche come CD137L e TNFSF9) è altamente espresso dalla maggior parte delle cellule immunitarie e da molte cellule non immunitarie e può ricevere e trasmettere segnali inversi in cellule come i macrofagi. L’accumulo di prove dimostra che le interazioni bidirezionali della superficie cellulare 4-1BB/4-1BBL nelle cellule immunitarie sono critiche nell’avviare e modulare varie risposte infiammatorie (ad esempio, artrite reumatoide, miocardite autoimmune e tumori ematologici maligni). Inoltre, le interazioni 4-1BB/4-1BBL-mediate si verificano anche tra cellule immunitarie e non immunitarie, influenzando nuovamente le risposte infiammatorie. Per esempio, l’interazione tra 4-1BB e 4-1BBL su cellule endoteliali e macrofagi è coinvolta nell’infiammazione vascolare, e l’interazione tra le due molecole su cellule epiteliali e cellule natural killer è coinvolta nel danno da ischemia-reperfusione renale. Abbiamo precedentemente dimostrato che l’espressione di 4-1BB e 4-1BBL è stato upregolato nel tessuto adiposo che è stato infiammato a causa di obesità, e che l’ablazione di 4-1BB ridotto l’infiammazione adiposa. Quindi, abbiamo ipotizzato che l’interazione tra 4-1BB e 4-1BBL sulle cellule adipose e le cellule immunitarie come i macrofagi gioca un ruolo nell’infiammazione adiposa nell’obesità.

In questo studio, dimostriamo per la prima volta che 4-1BB è espresso sugli adipociti ed è upregolato da fattori legati all’obesità, e dimostriamo che la segnalazione bidirezionale 4-1BB/4-1BBL-mediata negli adipociti/macrofagi gioca un ruolo cruciale nell’iniziare e promuovere la cascata infiammatoria adiposa indotta dall’obesità.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali

I topi C57BL/6 (maschi, 8 settimane di età) (Orient Ltd., Busan, Corea) sono stati alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi (HFD, 60% di calorie da grassi (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); topi obesi) o una dieta a basso contenuto di grassi (LFD; 10% di calorie da grassi (Research Diets); topi nonobesi) per 9 settimane. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico dell’Università di Ulsan e conformi alle linee guida del National Institutes of Health.

2.2. Anticorpi

I topi nudi sono stati innescati con pristane e iniettati intraperitonealmente con un ibridoma subclonato che produce un anticorpo monoclonale (Ab) agonistico contro 4-1BB (3E1) per indurre la formazione di ascite. L’Ab monoclonale è stato purificato dal liquido ascitico mediante cromatografia su colonna di affinità con la proteina G-Sepharose (Sigma-Aldrich). Il 4-1BB Fc ricombinante (r4-1BB Fc) è stato acquistato da Adipogen (Seoul, Corea). Ab monoclonale antagonista contro 4-1BBL (TKS-1) è stato acquistato da e-Bioscience (San Diego, CA, USA). L’immunoglobulina G di ratto (Rat IgG) e le IgG1 umane sono state acquistate da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) e utilizzate come controllo.

2.3. Colture cellulari e trattamenti

La linea cellulare di macrofagi murini Raw264.7 è stata ottenuta dalla Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Seoul, Corea). Questa linea cellulare è stata mantenuta in RPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) contenente il 10% (vol/vol) di FBS (siero bovino fetale) (Gibco BRL, NY, USA) e incubata a 37°C in umidificazione al 5% di CO2. I preadipociti 3T3-L1 sono stati mantenuti in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) ad alto contenuto di glucosio (Gibco BRL, NY, USA) contenente il 10% di FBS. 3T3-L1 preadipociti confluenti (giorno 0) sono stati incubati in DMEM contenente 10 μg/mL insulina (Sigma-Aldrich), 0.25 μM DEX (desametasone, Sigma-Aldrich), 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methyl-xanthine, Sigma-Aldrich), e 10% FBS per 2 giorni. In breve, le cellule 3T3-L1 sono state differenziate in adipociti maturi mediante incubazione in DMEM con 10% FBS e 5 μg/mL di insulina per 2 giorni. Gli adipociti maturi sono stati mantenuti in questo mezzo, e il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo fresco ogni 2 giorni. L’acido grasso libero (FFA, miscela di acido palmitico, Sigma-Aldrich) è stato sciolto in etanolo contenente sieroalbumina bovina (BSA, 25 μM) e coniugato con BSA ad un rapporto molare 10 : 1 prima dell’uso. Gli adipociti 3T3-L1 (3 × 105 cellule/pozzetto) o i macrofagi Raw264.7 (3 × 105 cellule/pozzetto) in piastre da 24 pozzetti, sono stati trattati con fattori legati all’obesità (acido palmitico: pal, lipopolisaccaride: LPS) per 24 h o 4 h, rispettivamente. Per stimolare 4-1BB sugli adipociti, gli adipociti 3T3-L1 su piastre a 24 pozzetti sono stati incubati con 4-1BB Ab agonistico (3E1, 1 μg/mL) o IgG di ratto per 48 h in mezzo senza siero. Per immobilizzare r4-1BB Fc o IgG1 umane su piastre di coltura, r4-1BB Fc o IgG1 umane sono state incubate in piastre da 24 pozzetti a 37°C per 1 h in un incubatore a CO2 e i pozzetti sono stati risciacquati con tampone fosfato (PBS). Le piastre sono state poi incubate con RPMI (10% FBS) a 37°C per 1 ora in un incubatore a CO2 e i pozzetti sono stati risciacquati con PBS. I macrofagi Raw264.7 sono stati incubati a 5 × 105 cellule/pozzetto in piastre a fondo piatto da 24 pozzetti pre-rivestiti con 100 ng/mL r4-1BB Fc o IgG1 umane per 24 h.

2.4. Isolamento delle cellule vascolari stromali dal tessuto adiposo

Per isolare la frazione vascolare stromale (SVF) del tessuto adiposo, i cuscinetti di grasso epididimico di topi C57BL/6 (maschi, 8 settimane di età) sono stati tritati e digeriti per 30 minuti a 37°C con collagenasi di tipo 2 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) in DMEM (pH 7,4). Le sospensioni risultanti sono state centrifugate a 500 g per 5 minuti. Il pellet è stato risospeso nel tampone di lisi degli eritrociti, e le sospensioni incubate a temperatura ambiente per 3 minuti, poi centrifugate a 500 g per 5 minuti. Dopo il lavaggio in DMEM, le sospensioni sono state passate attraverso reti di nylon sterili da 100 μm (SPL Lifescience, Pocheon, Corea). Le cellule filtrate sono state trasferite in piatti da 100 mm2 contenenti DMEM integrato con 10% FBS e 0,4% Fungizone e mantenute in un incubatore a 37°C in 5% CO2. Le cellule sono state lasciate attaccare e le cellule galleggianti sono state rimosse per aspirazione e il mezzo di coltura è stato reintegrato per ogni giorno. Le cellule SVF sono state raccolte dopo 2 giorni. Le cellule SVF sono state piastrate a 5 × 105 cellule/pozzetto in piastre da 24 pozzetti. I preadipociti SVF derivati confluenti sono stati differenziati in adipociti mediante trattamento con DMEM contenente 10 μg/mL di insulina (Sigma-Aldrich), 0.25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0.5 mM IBMX (Sigma-Aldrich), e 10% FBS per 2 giorni. Gli adipociti maturi sono stati mantenuti nel terreno di coltura che è stato sostituito con terreno fresco ogni 2 giorni. Per rilevare l’espressione 4-1BB e 4-1BBL su adipociti derivati da SVF esposti a fattori obesi, queste cellule incubate con acido palmitico 250 μM, LPS 100 ng/mL per 24 h.

2.5. Isolamento dei macrofagi peritoneali

I topi C57BL/6 (maschi, 8 settimane di età) sono stati iniettati intraperitonealmente con 3 ml di brodo di tioglicolato al 3% (Difco, Detroit, MI, USA) 4 giorni prima di essere uccisi. Macrofagi peritoneali sono stati raccolti per centrifugazione in media MEM (Minimum Essential Medium, Gibco) e il pellet risultante è stato lavato e risospeso in MEM medio di cultura con 10% FBS. I macrofagi peritoneali sono stati purificati mediante adesione a piastre di coltura di tessuti per 2 ore. Per rilevare l’espressione 4-1BB e 4-1BBL sui macrofagi peritoneali esposti a fattori obesi, queste cellule incubate con acido palmitico 250 μM, LPS 100 ng/mL per 4 h.

2.6. Cocoltura di adipociti e macrofagi

3T3-L1 adipociti sono stati coltivati e differenziati per 6 giorni. La cocoltura di adipociti e macrofagi è stata eseguita con due metodi: cocoltura a contatto diretto e cocoltura transwell. Nel sistema di contatto diretto, i macrofagi Raw264.7 (3 × 105 cellule: 50% macrofagi, 3 × 104 cellule: 10% macrofagi) o i macrofagi peritoneali (3 × 105 cellule) sono stati posti in piastre da 24 pozzetti contenenti adipociti 3T3-L1 (3 × 105 cellule). Le cellule sono state coltivate per 24 ore a contatto tra loro e raccolte. Come controllo, gli adipociti e i macrofagi sono stati coltivati separatamente, con un numero di cellule per pozzetto uguale a quello del sistema a contatto e mescolati dopo la raccolta. Nel sistema trans-well, le cellule sono state coculturate utilizzando inserti trans-well con una membrana porosa 0.4 μm (Corning, NY, USA) per separare gli adipociti (3 × 105 cellule, pozzetto inferiore) dai macrofagi (3 × 105 cellule, pozzetto superiore). Dopo l’incubazione per 4 h, 8 h e 12 h, i surnatanti sono stati raccolti.

2.7. Misurazione dei livelli di citochine

I livelli di citochine nei surnatanti di coltura sono stati misurati utilizzando saggi di immunosorbimento enzimatico (ELISA). I saggi sono stati condotti utilizzando OptEIA mouse TNFα, un set MCP-1 mouse (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) e un set IL-6 e adiponectina mouse (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), e IL-10 kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). I valori dei livelli delle citochine sono stati derivati da curve standard utilizzando il programma di adattamento delle curve SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2.8. PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

L’RNA totale estratto dalle cellule coltivate è stato trascritto inversamente per generare cDNA usando la trascrittasi inversa M-MLV (Promega, Madison, WI, USA). L’amplificazione PCR in tempo reale del cDNA è stata eseguita in duplicato con un kit SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) utilizzando un Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Giappone). Tutte le reazioni sono state eseguite con la stessa procedura: denaturazione iniziale a 95°C per 10 s, seguita da 45 cicli di 95°C per 5 s e 60°C per 30 s. Tutti i valori dei geni di interesse sono stati normalizzati ai valori dei geni housekeeping (36B4 per gli adipociti; β-actina per macrofagi e cocolture). Le sequenze di primer del topo utilizzate sono riportate nella tabella 1.

I dati sono stati analizzati utilizzando Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.). Le curve standard relative sono state generate tracciando i valori di soglia del ciclo (Ct). Sulla base dei valori Ct ottenuti da ciascun campione, le quantità relative di geni bersaglio sono state calcolate utilizzando le curve standard con il software fornito da Takara Thermal Cycler Dice Real Time System.

2.9. Separazione di adipociti e macrofagi

Gli adipociti 3T3-L1 coltivati e i macrofagi Raw264.7 in numero uguale (come descritto in precedenza) sono stati separati seguendo il protocollo del produttore, utilizzando il sistema CD11b MicroBeads (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA). In breve, le cellule coculturate sono state raccolte, lavate due volte con tampone (PBS integrato con 2 mM EDTA e 0,5% sieroalbumina bovina-BSA), e incubate con microsfere CD11b per 15 minuti a 4°C. Le cellule lavate e risospese sono state applicate alla colonna MACS, che ha trattenuto le cellule CD11b+ e ha permesso alle cellule negative (adipociti) di passare attraverso. La colonna è stata poi rimossa dal separatore e posta su una provetta di raccolta adatta. Quantità appropriate di tampone della colonna sono state pipettate sulla colonna per far uscire le cellule positive (macrofagi) usando uno stantuffo fornito con la colonna. Questo metodo ha prodotto dal 90% al 95% di cellule CD11b+ pure, come valutato dalla citometria a flusso.

2.10. Analisi della citometria a flusso (FACS)

3T3-L1 adipociti e Raw264.7 macrofagi trattati con fattori legati all’obesità (come descritto in precedenza) sono stati delicatamente tripsinizzati, lavati due volte in PBS, e incubati con anticorpi bloccanti il recettore Fcγ (24G2) per 10 minuti in ghiaccio, poi colorati con ficoeritrina (PE) coniugata anti-4-1BB (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-4-1BBL (eBioscience), o anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) e anti-CD11b (eBioscience) come controllo per definire il gate degli adipociti/macrofagi. Le cellule sono state poi lavate con tampone FACS e analizzate su un FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) con il software CellQuest (BD Biosciences). Il numero nei grafici indica le percentuali di cellule positive.

2.11. Analisi Western Blot

3T3-L1 adipociti sono stati placcati a 1 × 106 cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti e incubati con 3E1 (1 μg/mL) o IgG di ratto per 3 ore. I macrofagi Raw264.7 sono stati placcati a 1 × 106 cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti rivestite con r4-1BB Fc o IgG umane per 1 ora. Il 3E1-trattato adipociti e r4-1BB Fc-trattati macrofagi sono stati risciacquati con PBS, risospesi per raschiamento in tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5% deoxycholate, 1% IGEPAL, e inibitori della proteasi cocktail), e centrifugato a 3000 rpm per 5 minuti. I campioni contenenti 10-30 μg di proteina totale sono stati sottoposti ad analisi western blot utilizzando anticorpi policlonali per IKK fosforilato (I kappa B chinasi alfa/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), IKKβ totale, p-p38 MAPK (mitogen-activated-protein kinase), p-JNK (c-Jun amino-terminal kinase), JNK totale, p-Akt (protein kinase B; Ser473), Akt totale (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), e IκBα (inibitore del fattore nucleare-κB alfa; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), e β-actina (Sigma).

2.12. Analisi statistica

I risultati sono presentati come media ± SEM di tre prove indipendenti eseguite in duplicato. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando il test di Student o l’ANOVA con il test di Duncan. Le differenze sono state considerate significative a .

3. Risultati

3.1. Espressione di 4-1BB e 4-1BBL negli adipociti/macrofagi e nel tessuto adiposo

Prima abbiamo misurato l’espressione di 4-1BB durante l’adipogenesi a livello di mRNA usando qRT-PCR. Abbiamo trovato che i livelli di trascrizioni 4-1BB erano maggiori negli adipociti derivati da SVF dopo la differenziazione (Figura 1(a)). È importante notare che le sostanze legate all’obesità come l’acido palmitico e LPS hanno significativamente aumentato i livelli dei trascritti 4-1BB negli adipociti derivati dalla SVF e i trascritti 4-1BBL nei macrofagi peritoneali (Figura 1(b)). L’upregulation dei trascritti è confermato negli adipociti 3T3-L1 e/o nei macrofagi Raw264.7 (Figura 1(c)). L’analisi FACS ha anche rivelato che la proteina 4-1BB sugli adipociti 3T3-L1 e la proteina 4-1BBL sui macrofagi Raw264.7 (Figura 1(d)) sono stati aumentati da questi fattori legati all’obesità. Inoltre, 4-1BB e 4-1BBL trascrizioni aumentato in adipociti/macrofagi coculturati (Figura 1 (e)), così come nel tessuto adiposo epididimale di topi obesi alimentati un HFD (Figura 1 (f)).

3.2. Rilascio di citochine infiammatorie e l’attivazione di molecole di segnalazione infiammatorie da 4-1BB e 4-1BBL stimolazione in adipociti e macrofagi, rispettivamente

Per esaminare se 4-1BB su adipociti o 4-1BBL su macrofagi fornire un segnale infiammatorio, abbiamo trattato ogni tipo di cellule con agonisti che stimolano specificamente queste molecole; Gli adipociti 3T3-L1 sono stati trattati con un anticorpo 4-1BB agonista (3E1) per 48 ore, e i macrofagi Raw264.7 macrofagi con r4-1BB-Fc per 24 h e abbiamo poi misurato i livelli di citochine infiammatorie nelle rispettive cellule. Sia la stimolazione 4-1BB degli adipociti che la stimolazione 4-1BBL dei macrofagi hanno aumentato notevolmente la produzione di citochine proinfiammatorie come MCP-1, TNF-α e IL-6 a livello di mRNA (Figure 2(a) e 2(c)) e di proteine (Figure 2(b) e 2(d)). La secrezione di adiponectina dagli adipociti non è stata alterata dalla stimolazione 4-1BB (dati non mostrati). La stimolazione 4-1BBL dei macrofagi ha diminuito le trascrizioni di IL-10 (Figura 2(c)), ma nessun cambiamento è stato osservato nel rilascio della proteina IL-10 (Figura 2(d)).

Figura 2

4-1BB o 4-1BBL stimolazione aumenta il rilascio di varie citochine infiammatorie da adipociti o macrofagi. Gli adipociti 3T3-L1 e i macrofagi Raw264.7 sono stati trattati con 1 μg/mL 3E1 e 100 ng/mL r4-1BB Fc, rispettivamente, per 48-24 ore. MCP-1, TNF-α, IL-6 e IL-10 sono stati misurati negli adipociti 3T3-L1 (a-b) e nei macrofagi Raw264.7 (c-d). La fosforilazione di IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt e β-actina sono stati misurati tramite western blotting. Gli adipociti 3T3-L1 sono stati incubati con 1μg/mL 3E1 per 3 h (e), e i macrofagi Raw264.7 con 100 ng/mL r4-1BB Fc per 1 h (f). I risultati della densitometria sono stati mostrati come percentuale del controllo. I dati sono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato. ; ; ; (rispetto al controllo).

Per comprendere i meccanismi molecolari attraverso i quali 4-1BB e/o 4-1BBL attivare la segnalazione infiammatoria in adipociti e/o macrofagi, abbiamo esaminato gli effetti della stimolazione 4-1BB/4-1BBL sulle molecole di segnalazione intracellulari. La stimolazione di 4-1BB sugli adipociti ha aumentato la fosforilazione di p38 MAPK e JNK così come la fosforilazione di IKK, la molecola a monte di NF-κB, e ha indotto la degradazione di IκBα (Figura 2(e)), mentre la stimolazione di 4-1BBL ha aumentato la fosforilazione di Akt e p38 MAPK, e JNK (Figura 2(f)), ma non ha avuto effetto sulla degradazione della proteina IκBα (Figura 2(f)) e la fosforilazione di IKK (dati non mostrati). Coerentemente con i rapporti precedenti, la segnalazione 4-1BBL non solo ha attivato p38 MAPK ma ha anche indotto l’attivazione di Akt nei macrofagi, portando ad un aumento dell’espressione delle citochine infiammatorie.

3.3. Rilascio di citochine infiammatorie in un sistema di cocoltura a contatto

Poiché la stimolazione di 4-1BB/4-1BBL ha aumentato il rilascio di citochine infiammatorie dagli adipociti e/o dai macrofagi, rispettivamente, abbiamo studiato se l’interazione cellula-cellula tramite molecole di superficie, presumibilmente 4-1BB/4-1BBL, ha un ruolo nell’iniziare e innescare risposte infiammatorie. Abbiamo prima coculturato adipociti 3T3-L1 e macrofagi Raw264.7 in un sistema di contatto diretto e abbiamo scoperto che la produzione di citochine infiammatorie IL-6, MCP-1 e TNF-α era correlata al numero di macrofagi nella cultura (Figure 3(a)-3(c)) e aumentava con il tempo (Figure 3(d)-3(f)).

3.4. Effetto dell’interruzione dell’interazione tra 4-1BB e 4-1BBL sul rilascio di citochine infiammatorie in un sistema di cocoltura a contatto

Per verificare se l’interazione 4-1BB/4-1BBL-mediata tra adipociti e macrofagi partecipa alla risposta infiammatoria nella cocoltura a contatto 3T3-L1 adipociti/Raw264.7 macrofagi, abbiamo bloccato l’interazione usando un anticorpo neutralizzante (TKS-1). L’anticorpo monoclonale neutralizzante reagisce specificamente con il 4-1BBL del topo, per cui il 4-1BBL non può legarsi al recettore 4-1BB e può interrompere l’interazione tra 4-1BBL e 4-1BB. Quindi, sia il segnale mediato da 4-1BB negli adipociti che quello mediato da 4-1BBL nei macrofagi può essere smussato dal trattamento con TKS-1. Abbiamo trovato che il trattamento con TKS-1 ha ridotto significativamente i livelli di IL-6, MCP-1, e TNF-α mRNA nel contatto coculturato adipociti/macrofagi (Figura 4 (a)). La riduzione dell’espressione di queste citochine infiammatorie è stata confermata a livello proteico (Figura 4(b)). Inoltre, abbiamo anche trovato che l’interruzione dell’interazione tra 4-1BB e 4-1BBL ha ridotto il rilascio di citochine infiammatorie da macrofagi peritoneali coculturati con adipociti (Figura 4(c)). Per esaminare i contributi relativi della segnalazione 4-1BB e 4-1BB all’espressione genica infiammatoria negli adipociti/macrofagi coculturati, abbiamo separato i macrofagi dagli adipociti e misurato i livelli di trascrizione delle citochine infiammatorie nei due tipi di cellule (Figura 4(d)). L’anticorpo neutralizzante ha ridotto significativamente l’aumento dei livelli di mRNA di IL-6, MCP-1 e TNF-α negli adipociti e nei macrofagi (Figure 4(e) e 4(f)).

4. Discussione

L’infiammazione adiposa indotta dall’obesità è caratterizzata dal reclutamento di macrofagi nel tessuto adiposo e i macrofagi sono una fonte importante di risposte infiammatorie. Il contatto cellula-cellula tra adipociti e macrofagi è considerato importante per innescare le vie infiammatorie nel tessuto adiposo, anche se non è chiaro quali molecole siano coinvolte. Studi recenti hanno dimostrato che l’impegno del recettore co-stimolatorio 4-1BB con il suo ligando 4-1BBL attraverso il contatto cellula-cellula modula varie risposte infiammatorie. In un lavoro precedente, abbiamo trovato che la carenza di 4-1BB ha ridotto l’infiammazione adiposa diminuendo il reclutamento dei macrofagi e il rilascio di citochine infiammatorie. Sulla base di questi risultati, abbiamo ipotizzato che 4-1BB/4-1BBL-mediata interazione cellula-cellula tra le cellule adipose e macrofagi potrebbe essere importante nella insorgenza e / o il mantenimento di obesità indotta infiammazione adiposa. È interessante notare che i trascritti 4-1BB negli adipociti e i trascritti 4-1BBL nei macrofagi sono stati marcatamente upregolati da fattori legati all’obesità (ad esempio, FFA e LPS), e la loro espressione è stata anche fortemente aumentata negli adipociti/macrofagi coculturati a contatto. Inoltre, l’upregulation di queste molecole è stata accompagnata da un maggiore rilascio di citochine infiammatorie dalle cellule. Questi risultati insieme all’upregulation nel tessuto adiposo obeso e alla riduzione dell’infiammazione adiposa nei topi obesi con deficit di 4-1BB suggeriscono che 4-1BB e 4-1BBL partecipano all’insorgenza e/o alla promozione delle risposte infiammatorie indotte dagli adipociti/macrofagi.

Per vedere se la 4-1BB sugli adipociti o la 4-1BBL sui macrofagi fosse responsabile dei segnali infiammatori che scatenano le risposte infiammatorie, abbiamo stimolato le cellule con agonisti che si legano specificamente alla 4-1BB o alla 4-1BBL. Abbiamo scoperto, per la prima volta, che la stimolazione della 4-1BB sugli adipociti ha aumentato notevolmente il rilascio delle citochine infiammatorie MCP-1, TNF-α e IL-6. La stimolazione della segnalazione inversa mediata da 4-1BBL, che è nota per attivare i macrofagi, ha anche aumentato i livelli di citochine infiammatorie. Prove recenti indicano che la segnalazione 4-1BB risulta nell’attivazione della via MAPK/NF-κB, che è TNF receptor-associated factor (TRAF)-2-dipendente nei linfociti. Negli adipociti, abbiamo trovato che la stimolazione di 4-1BB ha attivato p38 MAPK, JNK, IKK e indotto la degradazione della proteina IκBα. D’altra parte, la stimolazione di 4-1BBL ha portato all’attivazione di molecole di segnalazione infiammatorie come Akt e p38 MAPK nei macrofagi, che è coerente con gli studi precedenti. Ancora più importante, abbiamo trovato che il trattamento con un anticorpo neutralizzante 4-1BBL ha ridotto il rilascio di citochine infiammatorie nelle cocolture sia a livello di mRNA che di proteine. Questi risultati insieme suggeriscono che l’interazione 4-1BB/4-1BBL-mediata tra adipociti e macrofagi innesca una segnalazione infiammatoria bidirezionale ed è un potente induttore di risposte infiammatorie nel tessuto adiposo obeso (Figura 5).

Figura 5

Rappresentazione schematica della trasduzione bidirezionale del segnale indotta dall’interazione 4-1BB/4-1BBL-mediata tra adipociti e macrofagi. Il rilascio di citochine infiammatorie (MCP-1, TNF-α e IL-6) in risposta alla segnalazione bidirezionale sembra partecipare all’infiammazione degli adipociti.

Interessante, l’interruzione dell’interazione 4-1BB/4-1BBL non ha completamente soppresso il rilascio di citochine infiammatorie da adipociti e macrofagi in cocoltura. Ciò può essere dovuto alla presenza di altre molecole di superficie cellulare che partecipano alle interazioni cellula-cellula e mediano le risposte infiammatorie. Infatti, gli adipociti e i macrofagi esprimono molti recettori e ligandi infiammatori sulla loro superficie. Per esempio, CD40 e herpes virus entry mediator (HVEM), che sono espressi sugli adipociti, sono considerati mediatori della segnalazione contatto-dipendente dei macrofagi, e l’ablazione di questi recettori riduce le risposte infiammatorie indotte dall’obesità. Quindi è concepibile che altri recettori e ligandi oltre a 4-1BB e 4-1BBL sono anche coinvolti nell’interazione tra adipociti e macrofagi che porta all’inizio e al mantenimento delle risposte infiammatorie.

In conclusione, abbiamo dimostrato per la prima volta che l’interazione contatto-dipendente tra adipociti e macrofagi mediata da 4-1BB e 4-1BBL, che genera segnali bidirezionali, gioca un ruolo cruciale nel rilascio di citochine infiammatorie adipose da queste cellule. 4-1BB e 4-1BBL, insieme ad altre molecole coinvolte nell’interazione cellula-cellula tra adipociti e macrofagi, possono essere obiettivi preziosi per prevenire l’infiammazione adiposa indotta dall’obesità.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca Midcareer attraverso la National Research Foundation (NRF) Grant KOSEF (2009-0079485), finanziato dal Ministero dell’Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (MEST), e dal programma Science Research Center (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-0000643) della NRF della Corea, finanziato dal MEST.