Siccome la quantificazione accurata delle proteine è essenziale per tutti gli esperimenti relativi agli studi sulle proteine, sono stati sviluppati diversi metodi per misurare la concentrazione delle proteine in un determinato saggio. Alcuni dei metodi più tradizionali di quantificazione delle proteine totali includono la misurazione dell’assorbanza UV a 280 nm (A280), i saggi dell’acido bicinchoninico (BCA) e Bradford, e altri metodi alternativi come Lowry e altri nuovi saggi.
Poiché le proteine assorbono la luce a una lunghezza d’onda specifica, la misurazione può essere ottenuta utilizzando uno spettrofotometro. In particolare, gli aminoacidi tirosina e triptofano hanno un assorbimento molto specifico a 280 nm, consentendo la misurazione diretta A280 della concentrazione proteica.
L’assorbanza UV a 280 nm è abitualmente utilizzata per stimare la concentrazione proteica nei laboratori grazie alla sua semplicità, facilità d’uso e convenienza. Le misurazioni sono rapide e altamente riproducibili poiché non c’è bisogno di incubazione. Inoltre, questo metodo richiede anche un volume di campione estremamente ridotto poiché gli spettrofotometri moderni utilizzano un sistema di ritenzione del campione durante la misurazione.
Tuttavia, occorre prestare attenzione per assicurarsi che il campione di proteine non contenga componenti non proteici (ad esempio acidi nucleici) con lo stesso spettro di assorbimento poiché potrebbe portare a risultati errati. Oltre a determinare le concentrazioni delle proteine, i valori di assorbanza possono anche essere utilizzati per rilevare i cambiamenti conformazionali e il legame dei ligandi e per seguire le reazioni enzimatiche.
L’effetto del triptofano e della tirosina nella quantificazione delle proteine
A causa della presenza di tirosina e triptofano, le proteine e i peptidi contenenti questi aminoacidi aromatici assorbono la luce UV a una lunghezza d’onda di 280 nm. Ognuno di questi residui ha lunghezze d’onda di assorbimento e di emissione distinte e varia nella resa quantica. Anche la fenilalanina e i legami disolfuro contribuiscono all’assorbimento a questa lunghezza d’onda, ma poiché è relativamente insignificante, può essere osservato solo in assenza di triptofano e tirosina.
Molti cofattori enzimatici contenenti strutture ad anello aromatiche (ad esempio FMN, FAD, NAD e porfirine) assorbono anche la luce UV per l’eccitazione e quindi aggiungono all’intensità della fluorescenza risultante. Proteine speciali come la proteina fluorescente verde hanno anche una sequenza interna di serinitirosina-glicina che è modificata post-traslazione ed è fluorescente nella regione della luce visibile.
Triptofano
Il triptofano è significativamente più fluorescente della tirosina e della fenilalanina. Tuttavia, le sue proprietà fluorescenti sono dipendenti dal solvente, cioè lo spettro si sposta verso lunghezze d’onda più corte e aumenta di intensità al diminuire della polarità del solvente. Come tale, i residui di triptofano sepolti nei domini idrofobici delle proteine ripiegate mostrano uno spostamento spettrale da 10 a 20 nm.
A causa della sua maggiore assorbibilità, della maggiore resa quantica e del trasferimento di energia di risonanza, lo spettro di fluorescenza di una proteina contenente i tre aminoacidi di solito assomiglia a quello del triptofano.
Tirosina
La tirosina può essere eccitata a lunghezze d’onda simili a quelle del triptofano, ma emette a una lunghezza d’onda nettamente diversa. Mentre può essere vero che la tirosina è meno fluorescente del triptofano, può fornire un segnale significativo poiché è spesso presente in gran numero in molte proteine. È stato osservato che la fluorescenza della tirosina viene spenta dalla presenza di società di triptofano nelle vicinanze attraverso il trasferimento di energia di risonanza o la ionizzazione del suo gruppo idrossile aromatico.
Questi sono alcuni punti importanti da ricordare quando si misurano i peptidi utilizzando il metodo A280.
- Proteine di peso molecolare simile possono avere valori di assorbanza diversi a causa della differenza nel contenuto di triptofano e tirosina.
- L’assorbanza UV è anche influenzata dalla struttura delle proteine. Così, le condizioni che influenzano la struttura (come la temperatura, il pH, la forza ionica, o la presenza di detergenti) possono influenzare la capacità dei residui aromatici di assorbire la luce a 280 nm, e cambiare il valore del coefficiente di estinzione della proteina.
- L’ambiente locale degli aminoacidi aromatici può avere un effetto sui loro spettri. Questo significa che il triptofano avrà un picco di emissione a lunghezze d’onda inferiori quando è sepolto nelle regioni interne idrofobiche di una proteina, mentre la tirosina trasferirà spesso la sua energia agli aminoacidi triptofano adiacenti. Il tirosinato ionizzato, che si forma quando i protoni vengono persi dalla tirosina in seguito all’aumento del pH, dimostrerà lunghezze d’onda simili al triptofano.