Caro Editore,
È stato recentemente sostenuto che il metodo di Ellman non ha sufficiente accuratezza per la misurazione delle attività delle colinesterasi (ChEs) (Komersová et al., 2007; Sinko et al., 2007; Pohanka et al., 2011; Dingova et al., 2014). Questo metodo è stato introdotto e descritto per la prima volta da Ellman e dai suoi colleghi e si basa sull’idrolisi del derivato della tiocolina (acetilico o butirrilico) da parte delle ChE (vere o pseudo) e sulla reazione della tiocolina risultante con il reagente tiolo 5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) e la formazione dell’anione 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB). La misurazione dell’assorbimento dello ione TNB a 410 nm per la pseudo-ChE e a 440 nm per l’acetil-ChE reticolocitica determina indirettamente l’attività della ChE (Ellman et al., 1961). Alcuni autori hanno proposto che l’indoxilacetato sia un substrato migliore dell’acetiltiocolina (ATCH) in quanto non reagisce con gli antidoti ossimici e il tiolo utilizzati per il metodo di Ellman (Pohanka et al., 2011). Inoltre, DTNB che è instabile, interagisce con i gruppi sulfidrilici liberi nel campione, e può influenzare l’attività della colinesterasi (Dingova et al., 2014). Altri ricercatori hanno dimostrato che gli ossimi reagiscono con ATCH (ossimolisi), producendo tiocolina e di conseguenza lo ione TNB (Sinko et al., 2007). Alcuni autori hanno anche menzionato che quando la concentrazione di DTNB è molto più alta della concentrazione di ATCH, il tasso di idrolisi di ATCH è diminuito con conseguente minore attività misurata di ChE (Komersová et al., 2007).
Anche se i problemi sopra menzionati sono stati dichiarati riguardo al metodo di Ellman, ognuno di essi ha la sua soluzione logica. In primo luogo, con la semplice diluizione appropriata del campione, anche i composti contenenti tioli e ossimi nel campione vengono diluiti e quindi l’entità della reazione del DTNB con queste sostanze è notevolmente ridotta (Mohammadi et al., 2017). In secondo luogo, i coefficienti di attenuazione molare di indoxilacetato e TNB sono 3900 M-1.cm-1 (Pohanka et al., 2011) e 13600 M-1.cm-1 (Ellman et al., 1961) rispettivamente. Pertanto, il limite di rilevamento per la misurazione dell’attività ChE da DTNB è circa 3,5 volte inferiore a quello dell’indoxilacetato. In terzo luogo, per concentrazioni di DTNB di 0,2-0,598 mM, il miglior rapporto tra le concentrazioni di DTNB/ATCH è 1,25-3,74 che risulta in un tasso ottimale di idrolisi di ATCH da parte di ChE (Komersová et al., 2007).