Nuove tecniche di isolamento dei microrganismi con enfasi sulla stampa laser | CDhistory

Nuovi metodi di isolamento

Al giorno d’oggi, una grande varietà di metodi viene utilizzata per esporre nuovi microrganismi, precedentemente non coltivati. In particolare, vengono utilizzati nuovi mezzi nutritivi contenenti sostanze specifiche; la coltivazione viene effettuata in diverse condizioni fisiche e chimiche dell’ambiente, come la composizione atmosferica, la temperatura e il pH. Inoltre, sono state studiate le applicazioni di mezzi nutritivi diluiti in combinazione con lunghi periodi di incubazione, così come la coltivazione congiunta di microrganismi di specie diverse. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati alcuni metodi di coltivazione fondamentalmente nuovi basati sul posizionamento dei microrganismi nell’ambiente naturale senza l’uso di mezzi nutritivi. Tali metodi utilizzano camere di diffusione e rivestimenti polimerici in cui sono collocate le cellule microbiche. In questo caso, i microrganismi ricevono tutti i nutrienti necessari dall’ambiente naturale, rimanendo isolati da esso. L’assegnazione di un nuovo produttore di antibiotici (teixobactin) utilizzando tali metodi è considerato un risultato importante. Un altro approccio prevede la coltivazione e lo screening simultaneo di decine e centinaia di migliaia di microcolonie batteriche su chip di isolamento in polimeri porosi o in ceramica. Per la coltivazione di microrganismi “incoltivabili”, possono essere utilizzati anche metodi che permettono l’isolamento di singole cellule da ambienti naturali. Tra questi metodi, il più popolare è basato sulla diluizione della sospensione dei microrganismi, la citometria a flusso e la selezione delle cellule, la microdissezione laser, la compartimentazione e l’applicazione di micromanipolatori. Oltre alla coltivazione di specie di microrganismi precedentemente non coltivate, l’isolamento di singole cellule microbiche è necessario per lo studio della fisiologia cellulare, delle interazioni tra cellule, così come per la ricerca di nuovi metaboliti, come antibiotici ed enzimi.

I moderni progressi scientifici e tecnologici forniscono molte opportunità in termini di sviluppo di nuovi metodi per la coltivazione, l’isolamento, la manipolazione e lo studio di singole cellule batteriche e dei loro consorzi. I nuovi approcci possono accelerare significativamente il processo di lavoro con i microrganismi e permettere di effettuare studi più completi ed esaustivi. È necessario notare che finora sono stati proposti pochissimi metodi per il posizionamento di array di batteri con precisione micrometrica. In Akselrod et al., reti tridimensionali (3D) di cellule viventi in idrogel sono stati formati senza perdita della loro vitalità utilizzando array di trappole ottiche olografiche multiplexed (tweezers) con una precisione senza precedenti (<400 nm). Per formare le trappole ottiche, sono stati utilizzati due laser: Laser Ar+ (20 W, lunghezza d’onda 514 nm) e laser ad onda continua Ti: Sapphire, sintonizzabile nell’intervallo di λ = 850-900 nm, così come una combinazione di due elementi di diffrazione, combinati con diverse lenti in un microscopio ottico invertito. Si sono formate reti di fibroblasti 3T3 circondati da un anello di batteri. È stata anche dimostrata la capacità di manipolare centinaia di batteri Pseudomonas aeruginosa simultaneamente in array bidimensionali (2D) e 3D. Il metodo di intrappolamento ottico olografico è molto accurato ma tecnicamente difficile da eseguire.

Nello studio di Rowan et al. viene proposto il metodo di funzionalizzazione eterogenea delle superfici, che è un processo litografico in quattro fasi basato sulla stampa a microcontatto di monostrati organici, l’impianto di polimero iperbrancato e la sua ulteriore funzionalizzazione. Come risultato, si ottengono strutture su cui si effettua l’inoculazione diretta di cellule batteriche. Le indagini sulla sopravvivenza cellulare hanno dimostrato che le cellule rimangono vitali sulle superfici strutturate ottenute. Sono stati ottenuti grandi isolati di batteri contenenti 18 ± 5 batteri e piccoli isolati contenenti 2 ± 1 batteri. Secondo questo articolo, il metodo dimostrato può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività e il biosensing. Tuttavia, è difficile combinare la funzionalizzazione eterogenea delle superfici con questo metodo con la ricerca biologica di routine e le condizioni di coltivazione dei microrganismi (temperatura, pH, nutrienti, ecc.). È necessario notare che il compito di trovare modi semplici per fornire un’alta risoluzione degli array di batteri viventi con l’opportunità di vari studi biologici è stato risolto in alcune pubblicazioni. Gli approcci proposti in questi lavori sono, infatti, i precursori della stampa 3D.

In uno studio di Weibel et al. è stata proposta la tecnica della stampa di batteri viventi su piastre di agarosio. Sono stati stampati array di batteri (la dimensione di una singola macchia con batteri >200 µm) nell’area fino a 50 cm2. I timbri in polidimetilsilossano (PDMS) sono stati prodotti con l’aiuto della tecnica fotolitografica. La dimensione minima raggiunta della sporgenza di stampa è stata di 190 µm all’altezza di 140 µm, che, tuttavia, è lontana dalla dimensione richiesta per separare i batteri. Questo metodo è veloce, riproducibile e conveniente e può essere usato per controllare il modello, la spaziatura e l’orientamento tra colonie di batteri diversi. Nello studio di Xu et al., gli array di batteri viventi con risoluzione cellulare sono stati stampati su substrato di agarosio utilizzando timbri elastomerici (PDMS) con un alto rapporto di aspetto, ottenuto con il metodo di litografia inversa in situ (RISL). La figura 1 mostra i vantaggi del metodo RISL rispetto alla fotolitografia ultravioletta standard. L’unica limitazione della tecnologia RISL è il diametro della protrusione, che difficilmente può essere <1 µm a causa del limite della diffrazione ottica.

Il metodo di stampa microcontatto di array di batteri funziona come segue: La goccia di Escherichia coli nel mezzo di coltura LB viene depositata sul gel di agarosio (3 peso % in LB) e, sul substrato di agarosio, si forma un monostrato di batteri (il liquido viene assorbito dal gel di agarosio). Poi, il timbro PDMS entra in contatto con un monostrato di batteri che copre il gel di agarosio. Il timbro viene rimosso e la parte di batteri rimane su di esso. Poi, al contatto del timbro con lo strato di gel di agarosio (4 wt% in LB, spessore 200 µm), i batteri vengono trasferiti allo strato di agarosio. Così, in pochi secondi, array di batteri di E. coli possono essere stampati direttamente sul substrato di agarosio con una risoluzione di micron, fino a singoli batteri, su una vasta area (cm2). È stato dimostrato che, dopo che il modello è stato stampato, i batteri continuano a crescere e a dividersi, come nelle condizioni della coltura di massa, cioè i batteri mantengono il loro normale comportamento fisiologico dopo la stampa. È stato anche dimostrato che la concentrazione di agarosio è cruciale per una buona performance di stampa. Una concentrazione troppo bassa porta a una distorsione del modello stampato, mentre una concentrazione troppo alta non è adatta alla coltivazione dei batteri. Per ottenere array di singoli batteri, è stato studiato l’effetto della riduzione della concentrazione iniziale dei batteri in una goccia del mezzo di coltura LB. Per le concentrazioni iniziali di 109 e 108 cellule/ml, il numero medio di batteri per spot è stato misurato a 12,1 e 1,4, rispettivamente. Una distribuzione molto stretta è stata ottenuta alla bassa concentrazione di batteri: Il 44,6% delle macchie aveva solo una cellula di E. coli e il 40,1% delle macchie aveva 0 o 2 cellule. Questi risultati hanno dimostrato che la stampa a microcontatto permette la produzione di array regolari di singoli batteri. Inoltre, è stato dimostrato che questo approccio alla separazione degli array batterici permette di analizzare i tassi di crescita delle singole linee di batteri. Questa metodologia fornisce un modo semplice per qualsiasi distribuzione spaziale 2D desiderata di batteri e può essere utilizzata sia per lo screening che per gli studi di variazione fenotipica batterica, dinamiche di popolazione ed evoluzione degli ecosistemi.

Un’area in rapido sviluppo – sociomicrobiologia – ha identificato i meccanismi con l’aiuto dei quali i batteri partecipano a relazioni collaborative e competitive influenzando i vicini vicini attraverso il contatto fisico e la modifica della composizione chimica del loro microambiente comune. Per esplorare il comportamento di piccoli aggregati microbici, sono state sviluppate diverse tecnologie di microprocesso che limitano i batteri in dispositivi microfluidici, microresonatori e goccioline di liquido a volume ultrabasso. La capacità di integrare i sistemi analitici con la microfluidica ha reso queste piattaforme di isolamento attraenti per lo screening ad alte prestazioni per la resistenza agli antibiotici e l’analisi dell’attività enzimatica. Per esempio, in Eun et al., sono descritti un’analisi ad alte prestazioni e l’isolamento di cellule batteriche incapsulate in microparticelle di agarosio con l’uso di ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Sono stati utilizzati sistemi microfluidici a flusso per creare microparticelle monodisperse con un diametro di ≈30 µm. Le dimensioni di queste particelle le hanno rese compatibili con la citometria a flusso e la FACS, e la sensibilità di questi metodi ha ridotto il tempo di incubazione per la replicazione cellulare prima di effettuare le analisi. Il piccolo volume delle microparticelle (≈1-50 picolitri) ha minimizzato il numero di reagenti necessari per gli studi batterici. Questa piattaforma ha reso possibile allocare e isolare i batteri in modo efficace, così come utilizzare la combinazione di metodi per una rapida identificazione di bersagli per piccole molecole biologicamente attive. Come dimostrazione sperimentale di questo metodo, le cellule di E. coli sono state incapsulate in microparticelle di agarosio, incubate in presenza di diverse concentrazioni di rifampicina e analizzate con l’uso di FACS. La concentrazione minima inibitoria della rifampicina è stata determinata, e i mutanti spontanei che avevano resistenza agli antibiotici sono stati isolati con l’aiuto della FACS e caratterizzati dal sequenziamento del DNA. Utilizzando questo approccio, il tempo e la quantità di antibiotici necessari per isolare i mutanti sono stati ridotti di 8 e 150 volte, rispettivamente, rispetto ai metodi microbiologici tradizionali che utilizzano piastre di agar nutrienti. Quindi, questo metodo è importante nei campi della biologia chimica, della chimica dei prodotti naturali, così come per la scoperta e la caratterizzazione di metaboliti secondari biologicamente attivi.

Gli approcci sopra menzionati sono stati utili per limitare la dimensione, la forma e gli attributi fisici (microhabitat); tuttavia, nessuno di essi ha fornito la possibilità di determinare la geometria 3D degli aggregati batterici o l’orientamento di più popolazioni arbitrariamente. Inoltre, il processo di incapsulamento delle cellule in cavità di volume ultra-basso spesso limita il trasporto di massa, portando a condizioni che sono incompatibili con la crescita e la segnalazione tra popolazioni fisicamente isolate. Un numero crescente di prove evidenzia l’importanza delle microcolonie nella riproduzione batterica; tuttavia, si osserva la mancanza di strumenti per la valutazione sistematica del comportamento delle cellule in tali comunità. Nuove strategie per la creazione di un ambiente culturale 3D su scala microscopica possono giocare un ruolo cruciale nell’identificare come i batteri gestiscono la resistenza agli antibiotici e altri comportamenti sociali in piccoli aggregati densi.

In Connell et al. e Connell et al., il metodo di formazione laser di camere 3D microscopiche basato sulla litografia multifotone (MPL) è descritto. Il metodo MPL ha un’alta capacità di produzione e la capacità di produrre modelli arbitrari. Offre opportunità per la produzione industriale di microdispositivi 3D come componenti micro-ottici, impalcature per l’ingegneria dei tessuti e chip microfluidici. Nello studio di Connell et al. l’albumina di siero bovino (BSA), una proteina altamente solubile che può essere reticolata in idrogeli porosi, durevoli e biocompatibili, è stata usata per creare microscopiche camere batteriche 3D. Alcuni batteri separati sono stati racchiusi nelle camere BSA con il volume di 1 pl e sono stati poi coltivati in popolazioni clonali. A causa della diffusione di molecole biologicamente significative e di antibiotici attraverso le pareti di BSA, così come lo scambio di segnali quorum-sensibili, il comportamento sociale delle comunità batteriche è stato studiato in relazione alla dimensione e alla densità della popolazione, alla forma del contenitore e alla velocità di flusso dell’ambiente.

Nel corpo umano, i batteri di solito esistono in comunità 3D strutturate composte da diverse specie batteriche. Per ottenere informazioni dettagliate sull’effetto della geometria sulla patogenicità, in Connell et al. viene descritta una strategia di stampa 3D per le comunità batteriche, in cui popolazioni fisicamente distinte ma chimicamente interattive di una certa dimensione, forma e densità possono essere organizzate essenzialmente in qualsiasi forma (Figura 2). Usando questo approccio, è stato dimostrato che la stabilità di una singola specie patogena di batteri all’antibiotico potrebbe aumentare la resistenza della seconda specie a causa delle loro relazioni 3D. Con l’aiuto della tecnica litografica laser, sono stati formati dei contenitori microscopici di volume fino a 1 pl con uno spessore della parete del contenitore fino a 2 µm intorno a batteri selezionati sospesi in gelatina, grazie alla reticolazione delle molecole polipeptidiche nella regione focale dovuta all’assorbimento non lineare della radiazione laser da parte delle molecole di fotosensibilizzatore. Il risultato di questo assorbimento multifotonico è la formazione di ossigeno singoletto, che stimola le reazioni di reticolazione covalente intramolecolare e intermolecolare tra BSA e gelatina. Le proprietà fisiche e chimiche uniche della gelatina hanno motivato l’interesse nel suo uso per una varietà di applicazioni, tra cui lo stoccaggio, l’immobilizzazione e la coltivazione 3D di batteri. Dopo la rimozione del reagente in eccesso, i batteri sono localizzati in cavità sigillate formate da gelatina reticolata, che è un materiale altamente poroso e supporta una rapida crescita di popolazioni di cellule completamente chiuse. È facilmente permeabile ai polipeptidi, agli antibiotici e ai segnali fisici e chimici con l’aiuto dei quali avviene l’interazione tra i batteri. L’isolamento delle cellule in microcontenitori fornisce l’opportunità di incorporare diversi tipi/densità di contenitori l’uno nell’altro, così come di cambiare dinamicamente l’orientamento delle intere popolazioni di batteri all’interno della comunità.

Gli autori hanno dimostrato che le interazioni spazialmente localizzate dello Staphylococcus aureus Gram-positivo e dei batteri Gram-negativi P. aeruginosa (due patogeni umani che spesso formano coinfezioni persistenti all’interno di ferite, cateteri e polmoni di pazienti con mucoviscidosi) possono aumentare la sopravvivenza dello stafilococco nel trattamento con gli antibiotici β-lattamici.

La stampa cellulare micro-3D espande fondamentalmente le possibilità di sondare la resistenza agli antibiotici quando un singolo microgruppo batterico può influenzare la suscettibilità agli antibiotici delle popolazioni adiacenti circostanti o incorporate – una questione di particolare rilevanza per le infezioni in vivo (ad es, ferite, cavità orale e fibrosi cistica dei polmoni) dove i tessuti sono spesso colonizzati da diverse specie di batteri contemporaneamente. Il vero potere della stampa cellulare 3D sta nella capacità di organizzare le comunità microbiche in una gamma illimitata di geometrie. La stampa cellulare micro-3D può anche essere uno strumento prezioso per le indagini dei meccanismi e delle dinamiche delle risposte adattative alle condizioni ambientali.