Un’importante modifica post-traslazionale degli istoni è l’acetilazione dei gruppi ɛ-ammino sui residui di lisina conservati presenti nelle code amino-terminali di queste proteine. L’acetilazione neutralizza le lisine caricate positivamente e quindi influenza le interazioni degli istoni con altre proteine e/o con il DNA. L’acetilazione degli istoni è stata a lungo associata alla cromatina trascrizionalmente attiva ed è anche implicata nella deposizione degli istoni durante la replicazione del DNA (1, 2). La prima clonazione di un gene dell’istone acetiltransferasi (HAT), il gene HAT1 del lievito, è stata riportata nel 1995 (3). Successivamente, è stato suggerito che la proteina HAT1 è citoplasmatica e coinvolta nella deposizione degli istoni (4), anche se la mancanza di fenotipi dei mutanti hat1 del lievito, così come la recente evidenza che sia gli enzimi umani che quelli del lievito sono nucleari (rif. 5; S. Tafrov e R.S, lavoro non pubblicato), rende poco chiara la funzione in vivo di HAT1.
Un importante passo avanti in questo campo è stata la purificazione e la clonazione di HAT A, un HAT dal macronucleo del ciliato Tetrahymena (6). La sequenza di HAT A ha mostrato che era simile a un noto coattivatore trascrizionale del lievito, GCN5. Da allora, numerosi studi hanno dimostrato che GCN5 (e il relativo P/CAF) sono HAT conservati la cui attività sui nucleosomi facilita l’inizio della trascrizione (rivista in rif. 7). È interessante notare che GCN5 da solo può acetilare gli istoni liberi (in particolare Lys-14 di H3) ma non i nucleosomi. L’acetilazione dei nucleosomi da parte di GCN5 richiede che sia in uno dei due grandi complessi proteici chiamati Ada e SAGA nel lievito (8). Negli ultimi anni diverse proteine dei mammiferi, non collegate a GCN5 ma implicate anch’esse nell’attivazione trascrizionale, hanno dimostrato di avere attività HAT. Queste includono CBP/p300, TAF250, ACTR e SRC-1 (9-12). Quindi, sta diventando chiaro che l’acetilazione degli istoni dei nucleosomi è una componente significativa del processo di attivazione genica multistep.
In questo numero dei Proceedings, Trievel et al. (13) riportano la struttura di cristallo del dominio catalitico HAT del lievito GCN5. Questo dominio comprende i residui 99-262 della proteina 439-aa. Una porzione della loro struttura, costituita da quattro filamenti β antiparalleli (β1-4), seguiti da un’α-elica (α3) e un altro filamento β (β5), è mostrata in Fig. Fig.1.1. Questa parte di GCN5 è molto simile nella struttura a quella di HAT1 del lievito (14), così come ad altre due N-acetiltransferasi i cui substrati non sono istoni, cioè l’aminoglicoside 3-N-acetiltransferasi (AAT; rif. 15) e la serotonina N-acetiltransferasi (16). Tutti questi enzimi sono membri di una famiglia di proteine identificate dall’analisi di sequenza come quelle che hanno somiglianza con le N-acetiltransferasi conosciute come GCN5, e quindi chiamate la superfamiglia GNAT (17). I membri di questa superfamiglia hanno la caratteristica comune di trasferire un gruppo acetile dall’acetil CoA a un gruppo amminico primario, anche se gruppi amminici molto diversi per i diversi enzimi; cioè su gruppi amminici sulle lisine nel caso degli HAT, su gruppi amminici α sui termini N delle proteine nel caso di enzimi come ARD1 o MAK3, su zuccheri nel caso di AAT (15) e GNA1 (18, 19), o sulla serotonina per la serotonina N-acetiltransferasi (16). Tutti i membri della superfamiglia GNAT hanno un motivo conservato chiamato motivo A (mostrato in rosso in Fig. Fig.1),1), e la maggior parte di loro hanno altri due motivi conservati chiamati B e D.
Diagramma a nastro di GCN5 che mostra il nucleo conservato trovato in quattro N-acetiltransferasi e in una N-miristoil transferasi. Il motivo A della superfamiglia GNAT è mostrato in rosso. L’acetil CoA presente in HAT1 è modellato nella struttura di GCN5. Lo zolfo nell’acetil CoA è mostrato in giallo.
È stato previsto che i motivi conservati nella superfamiglia GNAT sarebbero stati coinvolti nel legame dell’acetil CoA perché è l’unico substrato che queste diverse N-acetiltransferasi hanno in comune (17). Infatti, la struttura di HAT1 con l’acetil CoA legato ha confermato che il motivo A è coinvolto nel legame del CoA (14), come il lavoro strutturale con l’aminoglicoside 3-N-acetiltransferasi (15) e la serotonina N-acetiltransferasi (20). In Fig. Fig.11 l’acetil CoA è stato modellato nella struttura di GCN5, sulla base della sua posizione in HAT1 (13, 14). L’acetil CoA è legato in una fessura a forma di V, formata tra i filamenti β 4 e 5. Il motivo A altamente conservato della famiglia GNAT si lega alla parte pirofosfato dell’acetil CoA. Le unità di pantotenato e di β-mercaptoetanolamina del CoA sono orientate lungo il β4 e si legano a idrogeno ad esso, imitando così un filamento β.
Trievel et al. (13) propongono un meccanismo per la catalisi di GCN5. Essi suggeriscono che un residuo di glutammato (Glu-173) è posizionato per astrarre un protone da un gruppo NH3+ sulla lisina da acetilare, in modo tale che il gruppo amminico scarico possa eseguire un attacco nucleofilo sul carbonio carbonile del gruppo tioestere reattivo dell’acetil CoA. La Fig.22 mostra una sovrapposizione delle regioni putative del sito attivo di GCN5 (in giallo) e HAT1 (in rosso) con l’acetil CoA legato. Ancora una volta, notate come le due proteine siano strutturalmente simili in questa regione. Secondo la proposta di Trievel et al., Glu-173 di GCN5, specialmente dopo il riorientamento della sua catena laterale, sarebbe abbastanza vicino alla lisina in arrivo per eseguire la catalisi della base. Infatti, la mutazione di Glu-173 a Gln abolisce l’attività in vivo e in vitro (13). Non ci sono residui Glu o Asp nella posizione corrispondente in HAT1. Notiamo, tuttavia, che Glu-255 o Asp-256 di HAT1 sul filamento β adiacente del cleft sono posizionati in modo che potrebbero svolgere la stessa funzione catalitica (Fig. (Fig.2).2). Questi residui non sono ancora stati mutati.
Superposizione di β4-α3-β5 di GCN5 (giallo) e la regione corrispondente di HAT1 (rosso). Le proteine sono rappresentate come tracce Cα con acetil CoA legato. Glu-173 di GCN5, ritenuto coinvolto nella catalisi, è mostrato in rappresentazione a sfera e bastoncino, così come i residui Glu-255 e Asp-256 di HAT1.
È chiaro dalle strutture di GCN5, HAT1, e altri due membri della superfamiglia GNAT che condividono un nucleo conservato, compreso il sito di legame per l’acetil CoA (Fig. (Fig.1).1). È interessante notare che la N-miristoil transferasi ha una struttura simile alle N-acetiltransferasi discusse sopra (21, 22), anche se questo enzima trasferisce un gruppo acile molto più grande dal miristoil CoA ai gruppi α-ammino delle glicine ai termini N delle proteine substrato. D’altra parte, il cloramfenicolo acetiltransferasi, che acetilatizza un gruppo idrossile, non ha una struttura simile. Sembra che gli enzimi GNAT che acetilano gruppi amminici su una serie diversificata di substrati leghino tutti l’acetil CoA in modo molto simile, e forse condividano un meccanismo catalitico simile. Naturalmente, questi enzimi differiscono nelle regioni che legano il substrato da acetilare. Per quanto riguarda gli HAT, il prossimo obiettivo sarà quello di determinare una struttura con un substrato istone o peptide legato all’enzima.