Implicazioni strutturali
Il risultato della modifica della proteina mutante contenente cisteina (K41C) con la bromoetilammina è un enzima molto simile alla RNasi A di tipo naturale. Tuttavia, il valore di kcat/Km per la catalisi della RNasi A K41S-etilaminocisteina è solo l’8% di quello dell’enzima naturale. La differenza nelle due proteine deve risiedere nelle differenze tra un gruppo tioetere e un gruppo metilene. Anche se gli angoli dei legami C-S-C tendono ad essere più acuti di quelli dei legami C-CH2-C, questa differenza è compensata dalla maggiore lunghezza dei legami C-S.3g,14 La modellazione molecolare indica che i gruppi amminici primari in S-etilaminocisteina e lisina possono essere sovrapposti entro 0,1 Å. Una differenza più significativa tra S-etilaminocisteina e lisina è la loro relativa preferenza per angoli di gauche piuttosto che anti-torsione.15 L’anti conformazione dei legami CC-CC è favorita da circa 0,8 kcal/mol nei composti modello.16 Infatti, l’angolo di torsione medio K41 è (175 ± 3)° nel complesso della RNasi A con 2′,3′-uridina vanadato ciclico (U>v), un analogo putativo dello stato di transizione (Figura 2). In contrasto con i legami CC-CC, la conformazione gauche dei legami CS-CC è favorita da 0,05-0,20 kcal/mol.17 La modellazione molecolare indica che il legame CS-CC di un residuo di S-etilaminocisteina in posizione 41 può essere nella conformazione gauche senza disturbare la struttura della proteina nativa. Quindi, le catene laterali di tioetere in posizione 41 sono probabilmente meno rigide ed estese delle catene laterali alchiliche. Abbiamo quindi supporre che la catalisi da parte dell’enzima S-etilaminocisteina non è così efficiente come quella da wild-type RNasi A a causa del costo entropico di fissare un tioetere nella conformazione tutto anti.
Struttura del sito attivo di RNasi A legato a uridina 2′,3′-ciclico vanadato. La struttura è stata raffinata a 2,0 Å da dati di diffrazione di raggi X e neutroni raccolti da cristalli cresciuti a pH 5,3. La catena laterale della fenilalanina 120 e la base di uracile non sono mostrate.
L’efficienza catalitica dipende dalla lunghezza della catena laterale del residuo 41. Le varianti di RNasi A che presentano un gruppo amminico alla fine di una catena laterale più lunga di quella della lisina sono catalizzatori più attivi rispetto alla RNasi A non modificata K41C. Ancora, gli enzimi in cui un gruppo amminico in posizione 41 è separato dalla catena principale da 4 atomi sono più attivi di quelli separati da 5 atomi. Questo risultato potrebbe derivare dall’entropia conformazionale aggiuntiva o dagli angoli di torsione sfavorevoli delle catene laterali più lunghe.
Nessun vantaggio significativo è ottenuto se il residuo 41 può donare un secondo legame a idrogeno. I gruppi guanidino e acetamidino hanno il potenziale di interagire simultaneamente con più di un ossigeno di un gruppo fosforilico. Per esempio, un gruppo guanidino è usato per legare gruppi fosforilici dalla proteina Tat dell’HIV-118 e dai recettori artificiali.19 Inoltre, nella nucleasi stafilococcica e nelle ribonucleasi della famiglia T1, un’arginina sembra svolgere il ruolo di K41 nella RNasi A.20 Abbiamo sostituito K41 con un residuo di arginina e un residuo S-acetamidino, che è un analogo breve dell’arginina. I valori di ΔΔG‡ per questi enzimi sono inferiori a quelli degli enzimi analoghi con solo un gruppo amminico primario nella catena laterale della posizione 41. Quindi, un legame a idrogeno sembra essere sufficiente per effettuare una catalisi efficiente. Questo risultato è coerente con il complesso cristallino della RNasi A con U>v (Figura 2). Il gruppo vanadilico in U>v è un bipiramide trigonale approssimativo con due ossigeni equatoriali che non si legano, O1V e O3V. L’ossigeno O1V accetta un legame a idrogeno dalla catena laterale della glutammina 11 mentre O3V accetta un legame a idrogeno dalla catena principale della fenilalanina 120. Solo O1V è in grado di accettare un legame a idrogeno da K41.
Implicazioni meccaniche. Il ruolo catalitico più comunemente attribuito a K41 è quello di stabilizzare l’eccesso di carica negativa costruita sugli ossigeni fosforilici nonbridanti durante la scissione dell’RNA (Figura 2). L’accumulo di carica potrebbe verificarsi in uno stato di transizione pentacoordinato (o intermedio fosforanico) quando il gruppo idrossile 2′ attacca il fosforo, sulla strada per spostare il nucleoside 5′. Si è ipotizzato che questa stabilizzazione avvenga tramite interazioni Coulombiane.12c,21 Ma, è stato anche proposto recentemente che la stabilizzazione avvenga tramite un breve e forte legame idrogeno che coinvolge il trasferimento parziale di un protone da K41.22
Le caratteristiche salienti di un residuo di lisina sono la sua carica positiva e la sua capacità di donare legami idrogeno. Tre dei 5 enzimi semisintetici e il K41R condividono queste caratteristiche. Non è semplice distinguere tra un’interazione basata unicamente su forze coulombiane e una basata su legami a idrogeno tra due specie cariche. Quella che segue è la spiegazione più semplice che è coerente con i dati della tabella 1.
La distinzione tra legami a idrogeno e forze coulombiane è più evidente in nessun luogo come in un confronto tra l’enzima S-etiltrimetilaminocisteina, che possiede una carica positiva terminale ma nessuna capacità di donare un legame a idrogeno, e l’enzima S-acetamidocisteina, che ha un ammide N-H per una potenziale donazione di legame a idrogeno ma manca una carica positiva. La bassa attività catalitica dell’enzima S-ethyltrimethylaminocysteine argomenta fortemente contro l’efficacia delle forze coulombiane nella stabilizzazione dello stato di transizione. A parità di condizioni, l’energia di un’interazione carica-carica diminuisce solo come l’inverso della distanza. Una maggiore distanza tra la carica positiva sulla catena laterale e gli ossigeni fosforilici, rispetto a quella dell’enzima S-etilaminocisteina, è imposta dai gruppi metilici. Tuttavia, è improbabile che questa distanza sia abbastanza grande da causare l’osservata riduzione di >103 volte del kcat/Km, soprattutto perché i tre gruppi metilici potrebbero essere facilmente accomodati nelle vicinanze degli ossigeni fosforilici (Figura 2).
La forza di un legame idrogeno dovrebbe essere correlata inversamente al pKa del protone donato, in quanto il legame idrogeno comporta una certa misura di trasferimento di protoni.23 Come mostrato nella Tabella 1, gli aumenti di pKa corrispondono effettivamente a diminuzioni di ΔΔG‡ per enzimi semisintetici con catene laterali di lunghezza comparabile. Per quegli enzimi semisintetici in cui la lunghezza della catena laterale è paragonabile alla lisina, la correlazione è, tuttavia, non lineare. Questa mancanza di linearità potrebbe sorgere perché il pKa di ogni catena laterale dipende dal suo particolare ambiente nella proteina nativa. Infatti, il pKa di Lys41 è stato determinato per essere 9.0,24 piuttosto che 10.6 come è elencato per lo ione butilammonio nella tabella 1. Diverse catene laterali possono essere influenzate in misura diversa. Un’altra, forse più significativa, fonte di non linearità è che le specie cariche tendono a partecipare a legami a idrogeno più forte di fare specie senza carica. Questo fenomeno è stato osservato per le proteine25 così come per le piccole molecole, comprese le ammine.26 Confrontando enzimi semisintetici con catene laterali che sono isosteriche ma differiscono per la carica formale, si dovrebbe rivelare tale tendenza. Per esempio, negli enzimi S-acetamidinocisteina e S-acetamidocisteina, le catene laterali in posizione 41 sono identiche tranne che per uno dei due eteroatomi attaccati al carbonio terminale. Eppure, la differenza nella capacità di queste due catene laterali isologhe di legarsi allo stato di transizione è maggiore di quella prevista dalla loro sola acidità. Qui, il legame a idrogeno donato da un’acetamidina carica è 4 kcal/mol più forte di quello di un’ammide non carica. Questo valore è coerente con altri dati sulla forza relativa dei legami a idrogeno carichi e non carichi nelle interazioni proteina-ligando.21 Infine, è degno di nota che anche se la catena laterale S-acetamido manca di una carica formale e ha un pKa relativamente alto, contribuisce ancora (anche se modestamente) alla catalisi. Questo risultato fornisce ulteriori prove dell’importanza per la catalisi di un legame a idrogeno donato dal residuo 41.
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