Polimorfismi genetici del citocromo P450 2D6 (CYP2D6): conseguenze cliniche, aspetti evolutivi e diversità funzionale

La farmacogenetica che si occupa delle differenze ereditarie nei bersagli dei farmaci, e della disposizione dei farmaci sotto forma di recettori e trasportatori di farmaci è in rapido sviluppo.1, 2, 3, 4, 5 Attualmente, le nostre conoscenze sono più avanzate per quanto riguarda l’influenza dei geni polimorficamente distribuiti che codificano gli enzimi che metabolizzano i farmaci, anche se la conoscenza dei recettori e dei trasportatori di farmaci è in rapida crescita. La maggiore importanza sulle differenze interindividuali nella risposta ai farmaci è attualmente esercitata dalle differenze nella capacità di metabolismo dei farmaci causate dal polimorfismo genetico o dall’inibizione o induzione del metabolismo dei farmaci. Oltre alle interazioni farmaco-farmaco, ai fattori fisiopatologici e ai fattori ambientali, la genetica degli enzimi che metabolizzano i farmaci gioca un ruolo critico per la comprensione delle differenze interindividuali nella risposta ai farmaci e nelle reazioni avverse ai farmaci. Il maggiore impatto tra gli enzimi che metabolizzano i farmaci è esercitato dai citocromi P450, i principali enzimi di fase I.6, 7 Tra questi, CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6 sono altamente polimorfici e rappresentano insieme circa il 40% del metabolismo epatico umano di fase I. Inoltre, i polimorfismi di CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 e CYP2C8 contribuiscono anche alle differenze interindividuali nel metabolismo dei farmaci. Il CYP2D6 è forse l’enzima che metabolizza i farmaci più ampiamente studiato nell’uomo; il suo polimorfismo ha un’elevata importanza clinica ed è stato il primo tra i P450 polimorfici ad essere caratterizzato a livello molecolare. Oggi sono stati identificati più di 48 diversi substrati di farmaci per questo enzima (Tabella 1) e il CYP2D6 è responsabile di circa il 25% del metabolismo dei farmaci conosciuti. Questo potrebbe tuttavia essere una leggera sovrastima, poiché in passato sono stati cercati specificamente i farmaci che sono metabolizzati da questo enzima, a causa della sua espressione polimorfica. Nella presente revisione, vengono descritte le attuali conoscenze e conseguenze della genetica molecolare del CYP2D6, nonché le conoscenze dell’impatto sul trattamento dei farmaci.

Caratteristiche generali del CYP2D6

CYP2D6 è un polipeptide di 497 aminoacidi. L’enzima rappresenta solo una piccola percentuale di tutti i P450 epatici, ma il suo ruolo nel metabolismo dei farmaci è ampiamente superiore al suo contenuto relativo (vedi Zanger et al8). I diversi modelli dell’enzima basati sulla struttura tridimensionale del citocromo P450 BM-3 o CYP2C5, e i risultati della mutagenesi diretta al sito differiscono molto tra loro. Nonostante il successo dei cristalli ben diffusi del CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 e CYP3A4 dei mammiferi, nessuno è ancora riuscito a ottenere buoni cristalli di CYP2D6. Si ritiene che tali cristalli siano necessari per ottenere un modello per modelli che siano di sufficiente risoluzione e accuratezza per, ad esempio, prevedere i farmaci che saranno substrati per questo enzima. Un tale modello sarebbe di grande importanza per l’industria farmaceutica perché il design di un farmaco che eviti che i composti siano substrati ad alta affinità per il CYP2D6 è fondamentale per un prodotto di successo sul mercato.

I substrati CYP2D6 sono basi lipofile con un atomo di azoto protonabile. La reazione di idrossilazione avviene a una distanza di 5 o 7 Å dall’atomo di azoto. Esperimenti di mutagenesi site directed indicano che Asp301 è l’amminoacido caricato negativamente responsabile del legame con l’azoto del substrato.8 Inoltre, anche Ser304, Thr309 e Val370 sembrano essere coinvolti nel legame del substrato9 , sebbene siano necessari ulteriori modelli per la conferma.

CYP2D6 ha un’affinità molto alta per gli alcaloidi (vedi Tabella 1).10 L’espressione dell’enzima, in contrasto con altri citocromi xenobiotici epatici metabolizzanti, non è regolata da nessun agente ambientale noto e non è inducibile da ormoni noti. Poiché nessun fenotipo è stato descritto tra i soggetti privi di CYP2D6 o che hanno fino a 13 copie attive del gene, si potrebbe concludere che l’enzima non ha una funzione endogena importante. È stato suggerito un ruolo per il metabolismo di alcuni neurotrasmettitori. Infatti, sono state presentate prove recenti che il CYP2D6 è una O-demetilasi specifica per la 5-metossi-indoletilammina,11 e anche la 5-metossitriptamina12 ha dimostrato di essere un substrato. Oltre a tali substrati, è probabile che l’enzima ha un ruolo importante per il metabolismo dei costituenti alimentari, in particolare alcaloidi (vedi sotto).

L’azione del CYP2D6 su substrati di potenziale attività nel cervello implicherebbe un fenotipo funzionale sui soggetti, cioè, poveri metabolizzatori (PMs) che mancano l’enzima. Infatti, due studi hanno indicato una relazione significativa tra il comportamento mediante test psicologici e la presenza del CYP2D6.13, 14 Ci si chiede se tale attività sia essenziale. È interessante notare che Pai et al15 hanno recentemente dimostrato che una variante comune dello pseudogene CYP2D7P potrebbe essere espressa in forma attiva nel cervello umano, producendo un prodotto enzimatico funzionale attivo nel metabolismo, ad esempio, della codeina. Se questo rappresenti un prodotto di vera importanza funzionale rimane da chiarire, anche se la scoperta in quanto tale è interessante.

Polimorfismo CYP2D6-Aspetti storici

Il polimorfismo del CYP2D6 fu scoperto indipendentemente in tre diversi laboratori. Il laboratorio di Folke Sjöqvist dimostrò che il metabolismo della nortriptilina e della desimipramina, che in seguito si dimostrarono substrati del CYP2D6, presentava un’enorme variazione interindividuale nei livelli plasmatici allo stesso dosaggio e furono identificati due fenotipi.16 Studi successivi del gruppo di Sjöqvist utilizzando gemelli rivelarono che la differenza era di natura genetica. Bob Smith e collaboratori a Londra studiarono il metabolismo di due farmaci antiipertensivi bethanidina e debrisochina, in uso per l’ipertensione. Quando Bob Smith nel maggio 1975 prese 40 mg di debrisochina, ebbe vertigini, svenimenti e soffrì di una grave ipotensione. Uno studio successivo con 10 mg di debrisochina in 94 soggetti identificò i due fenotipi.17 Michel Eichelbaum a Bonn studiò gli effetti antiaritmici della sparteina e due soggetti lamentarono spiacevoli effetti collaterali come visione offuscata, diploide, vertigini e mal di testa. L’analisi dei livelli plasmatici rivelò che avevano livelli 4-5 volte più alti degli altri e i due fenotipi furono pubblicati nel 1978 e 1979.18, 19

La base genetica dietro il polimorfismo della sparteina fu chiarita 10-15 anni dopo. In uno studio collaborativo tra i laboratori di Urs Meyers e Frank Gonzalez, gli anticorpi policlonali del CYP2D del ratto sviluppati a Basilea furono usati come strumenti per clonare il cDNA del CYP2D6 umano da una libreria di cDNA del fegato umano λgt 11 e il cDNA espresso aveva l’attività di idrossilasi del bufuralolo prevista.20 Utilizzando la RFLP, il laboratorio di Meyers ha potuto confermare i pattern RFLP alterati nei PM per la debrisochina,21 mentre l’identificazione completa degli alleli CYP2D6*3 e CYP2D6*4 è stata pubblicata nel 1990.22

Alla fine degli anni ’80 abbiamo identificato, in fruttuosa collaborazione con Leif Bertilsson e Folke Sjöqvist, un pattern RFLP nei cinesi attivo nel metabolismo del CYP2D6, indicativo per i PM nei caucasici23 e successivamente abbiamo caratterizzato l’allele CYP2D6 parzialmente difettoso più comune negli orientali, CYP2D6*10.24 Il gruppo francese si è opposto alla nostra identificazione delle dimensioni dei frammenti XbaI cinesi e abbiamo riesaminato diversi campioni di DNA mediante XbaI RFLP utilizzando una densità inferiore del gel di agarosio e abbiamo trovato alcuni campioni che pensavamo avessero DNA non depurato (vedi Ingelman-Sundberg25 per ulteriori dettagli). Tuttavia, l’esame della loro origine ha rivelato che provenivano da individui molto rapidi per il metabolismo della debrisochina e sono stati identificati soggetti con fino a 12 copie extra del gene CYP2D6. Questa risultò essere la prima descrizione di un gene attivo amplificato in modo stabile nell’uomo26 e fu definito il termine metabolizzatori ultrarapidi (UMs).27 Successive indagini sulle frequenze in diverse popolazioni rivelarono il 30% negli etiopi,28 il 10% negli spagnoli e il 10% delle popolazioni in Italia e Turchia, mentre gli UMs sono poco comuni (1-2%) nel Nord Europa e sostanzialmente assenti in Asia (vedi6 per i riferimenti). Negli etiopi non abbiamo trovato nessun individuo omozigote per i geni CYP2D6 difettosi, ma alleli contenenti 2, 3, 4 nonché 5 copie del gene CYP2D6.28 Una situazione simile è stata vista anche tra i sauditi.29 La valutazione del numero di soggetti portatori di duplicazioni del gene CYP2D6 in Europa occidentale rivela che il 5,5% degli europei è portatore di più di due copie attive del gene CYP2D6 ed è UM (Tabella 2).

Polimorfismo genetico del CYP2D6

Il gene CYP2D6 è localizzato sul cromosoma 22q13.1. Il locus contiene due pseudogeni vicini, CYP2D7 e CYP2D8.30 L’evoluzione del locus CYP2D umano ha comportato l’eliminazione di tre geni e l’inattivazione di due (CYP2D7P e CYP2D8P) e la parziale inattivazione di uno (CYP2D6). Attualmente sono noti più di 46 diversi alleli polimorfici principali del CYP2D6. La presenza di pseudogeni altamente simili e strettamente localizzati, portatori di mutazioni dannose, ha portato, per esempio, attraverso reazioni di crossover ineguali, alla formazione di molti alleli CYP2D6 varianti, che più comunemente codificano prodotti genici difettosi. L'”attività” del locus CYP2D è elevata rispetto, per esempio, al locus CYP2C e di conseguenza si sono formati molti alleli varianti in un periodo di tempo relativamente breve. Gli alleli varianti più comuni distribuiti nei diversi gruppi etnici sono elencati nella tabella 3 e tutti gli alleli varianti sono presentati nella home page del comitato per la nomenclatura degli alleli del CYP umano (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). Gli alleli varianti del CYP2D6 possono essere classificati in categorie che causano un’attività cataxlitica abolita, diminuita, normale, aumentata o qualitativamente alterata. Tra le varianti più importanti vi sono CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 e CYP2D6*41.

L’allele più comune negli asiatici (frequenza allelica di >50%) e quindi forse l’allele CYP2D6 più comune al mondo è CYP2D6*10.24 L’enzima CYP2D6.10 ha una mutazione deleteria P34S che abolisce l’importante sequenza PPGP necessaria per il folding del P450 ed è quindi molto instabile,24 ma ha anche una ridotta affinità per i substrati.31 Tra i neri il CYP2D6*17, descritto per la prima volta nel 199632 , è la principale variante dell’allele CYP2D6. Esso codifica, oltre alle due mutazioni missenso viste nel CYP2D6*2, anche la T107I, che apparentemente crea una struttura alterata del sito attivo. Questo crea un’alterata specificità del substrato,33 che è evidente in vitro33 ma anche quando i soggetti del genotipo CYP2D6*17 vengono fenotipizzati in vivo.34, 35 In generale, l’attività dell’enzima CYP2D6.17 è inferiore a quella dell’enzima wild-type.

CYP2D6*41 è una variante del CYP2D6*2 avente -1584 C invece di G. È meno espressa del corrispondente allele CYP2D6*2 (vedi Zanger et al36). È plausibile che -1584G>C sia in linkage disequilibrium con un altro SNP che causa uno splicing carente dell’mRNA, sebbene ciò debba essere esplicitamente dimostrato. L’effetto in vivo di CYP2D6*41 è comunque piuttosto pronunciato e i soggetti omozigoti per questo allele sono fenotipicamente come gli individui del fenotipo intermedio (IM) con un allele CYP2D6 carente.36

Evoluzione dei loci CYP2D

C’è una drastica differenza tra roditori ed esseri umani nel numero di geni CYP2D attivi. Mentre il topo ha nove diversi geni Cyp2d attivi,37 l’uomo ne porta solo uno, che in effetti è assente nel 7% della popolazione caucasica (Figura 1). L’enzima CYP2D6 è noto per avere un’affinità molto elevata per le tossine vegetali come gli alcaloidi.10 È ragionevole supporre che il topo abbia mantenuto i geni attivi a causa della necessità di un potenziale di disintossicazione alimentare, mentre il cibo più ristretto assunto dagli esseri umani in passato, compresa la capacità intellettuale di trasferire informazioni riguardanti il cibo adatto tra le generazioni, ha portato alla perdita di una pressione di selezione per mantenere i geni attivi.

Il gene CYP2D6 non è inducibile in senso comune attraverso un aumento dell’espressione del prodotto genico. In Drosophila, si verifica una selezione selettiva dei ceppi che vivono, per esempio, nella zona del cactus Senita che secerne alcaloidi isochinolinici tossici e solo la Drosophila mettleri ma nessun ceppo di Drosophila melanogaster sopravvive in questa zona perché la loro capacità di indurre CYP6 e CYP28.38 Un’interessante selezione genetica avviene anche in Drosophila essendo resistente agli insetticidi. Dal 1930 al 1960, le macchie resistenti agli insetticidi si sono rapidamente evolute. È interessante notare che la base genetica molecolare sembra essere la selezione per un inserimento di un trasposoma (elemento di accordo) nella regione 5′-regolatoria del gene Cyp6b che causa un’espressione da 40 a 100 volte superiore del prodotto genico.39 Un altro meccanismo di acquisizione della resistenza agli insetticidi nella Drosophila è esemplificato dalla selezione per tre mutazioni chiave nel CYP6A2, cioè R335S, L336V e V476L, rendendo l’enzima attivo verso il metabolismo del DDT.40 Un’illustrazione di tre diversi meccanismi di risposta adattativa verso lo stress da substrato è mostrata nella figura 2.

Similmente, abbiamo proposto che tale selezione si sia verificata per alleli portatori di più geni CYP2D6 attivi nell’Africa nord-orientale. La base di questa selezione sarebbe la capacità dell’enzima CYP2D6 di detossificare gli alcaloidi, aumentando così la disponibilità di cibo potenziale tra i portatori di più copie del gene CYP2D6. Questo sarebbe molto vantaggioso per la sopravvivenza in periodi di fame quando solo una frazione della popolazione in questa regione raggiunge la maturità. L’esame del tasso di metabolismo della debrisochina negli etiopi che vivono in Etiopia rispetto agli etiopi che vivono in Svezia ha rivelato che gli etiopi nativi dello stesso genotipo erano più lenti nel loro metabolismo rispetto agli etiopi in Svezia, mentre non sono state trovate differenze significative nel tasso delle reazioni catalitiche dipendenti dal CYP2C19 misurate con S-mefenitoina.41 Questo può essere interpretato nel senso che i costituenti del cibo etiope, presumibilmente alcaloidi, inibiscono l’attività del CYP2D6 e che tali componenti potrebbero effettivamente essere un fattore di selezione genetica. Proponiamo che la popolazione etiope si sia espansa circa 10 000-20 000 anni fa a tal punto che il cibo rappresentava un vincolo importante. Durante i periodi di fame, una pressione di selezione si è verificato favorendo la sopravvivenza di soggetti in grado di detossificare le tossine vegetali in misura maggiore, aumentando il numero di piante in grado di fornire cibo utile (Figura 3). Questo ha creato un’espansione delle sottopopolazioni portatrici di più copie di geni CYP2D6 attivi e anche senza geni CYP2D6 inattivi. Poiché le varianti di gran lunga più comuni del gene CYP2D6 duplicato e multiduplicato sono CYP2D6*2 e CYP2D6*41, che creano entrambe due sostituzioni di aminoacidi rispetto al CYP2D6*1, si può ipotizzare che la specificità del substrato di questa forma di enzima sia vantaggiosa per il metabolismo di alcuni prodotti vegetali. Le successive migrazioni di soggetti dall’Africa nord-orientale verso l’area mediterranea hanno portato all’alta frequenza di UM nell’Europa meridionale (cfr. tabella 2).