Potere diagnostico dei test di laboratorio per la sferocitosi ereditaria: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics

Abstract

Background La diagnosi di laboratorio della sferocitosi ereditaria si basa comunemente su test di fragilità osmotica dei globuli rossi a base di NaCl o di glicerolo; più recentemente, è stato proposto un test che mira direttamente al difetto molecolare della sferocitosi ereditaria (eosin-5′-maleimide-binding test). Nessuno dei test disponibili identifica tutti i casi di sferocitosi ereditaria.Abbiamo confrontato le prestazioni del test di legame eosina-5′-maleimide, gli studi di fragilità NaCl-osmotica su sangue fresco e incubato, il test di lisi con glicerolo, il test di lisi con glicerolo acidificato e il test di Pink su una serie di 150 pazienti con sferocitosi ereditaria raggruppati in base al fenotipo clinico e alla proteina difettosa, con lo scopo finale di trovare la combinazione di test associati al più alto potere diagnostico, anche nei casi più lievi di sferocitosi ereditaria.Risultati Il test di legame eosina-5′-maleimmide aveva una sensibilità del 93% e una specificità del 98% per rilevare la sferocitosi ereditaria: la sensibilità era indipendente dal tipo e dalla quantità del difetto molecolare e dal fenotipo clinico. Il test di lisi con glicerolo acidificato e il test di Pink hanno mostrato una sensibilità comparabile (95% e 91%). La sensibilità dei test di fragilità osmotica NaCl, comunemente considerati il gold standard per la diagnosi di sferocitosi ereditaria, era del 68% su sangue fresco e dell’81% su sangue incubato, e diminuiva ulteriormente nei casi compensati (53% e 64%, rispettivamente). La combinazione del test di legame eosina-5′-maleimmide e del test di lisi con glicerolo acidificato ha permesso di identificare tutti i pazienti con sferocitosi ereditaria. Il test di legame eosina-5′-maleimide ha mostrato la maggiore specificità della malattia.Conclusioni Ogni tipo di test non riesce a diagnosticare alcuni casi di sferocitosi ereditaria. L’associazione di un test di legame eosina-5′-maleimmide e di un test di lisi con glicerolo acidificato ha permesso di identificare tutti i pazienti con sferocitosi ereditaria in questa serie e, pertanto, rappresenta una strategia diagnostica attualmente efficace per la sferocitosi ereditaria, compresi i casi lievi/compensati.

Introduzione

La sferocitosi ereditaria è la più comune anemia emolitica congenita nei caucasici e colpisce circa 1 su 1000-2000 individui.1,2 Il difetto molecolare è altamente eterogeneo e coinvolge i geni che codificano per la spectrina, l’anchirina, la banda 3 e la proteina 4.2,3 e il grado di emolisi varia ampiamente, da un’anemia completamente compensata a un’anemia trasfusione-dipendente.

Il tipico segno distintivo di laboratorio della sferocitosi ereditaria, sebbene non specifico, è la presenza di sferociti su uno striscio di sangue periferico, che sono rilevabili nel 97% dei pazienti.4 Tuttavia, ci possono essere pochissimi sferociti in alcuni pazienti4,5 e sono quindi necessari operatori esperti per rilevarli; inoltre, l’esame microscopico dei globuli rossi è sempre più omesso nell’era dell’automazione di laboratorio. La diagnosi di laboratorio della sferocitosi ereditaria si basa quindi comunemente su test che sfruttano il rapporto superficie-volume, tipicamente ridotto negli eritrociti sferici, in particolare i test di fragilità osmotica dei globuli rossi a varie concentrazioni di cloruro di sodio (NaCl) su sangue fresco e incubato,6 e i test che misurano l’entità o il tasso di lisi dei globuli rossi sospesi in soluzioni di glicerolo tamponato, cioè la lisi con glicerolo.Il test di lisi con glicerolo (GLT),7 il test di lisi con glicerolo acidificato (AGLT)8 e il test di Rosa.9 Tuttavia, questi test non rilevano una percentuale variabile di casi di sferocitosi ereditaria, in particolare quelli più lievi,6,10-12 e non differenziano la sferocitosi ereditaria dalla sferocitosi secondaria associata ad altre condizioni, principalmente anemie emolitiche autoimmuni.13-Più recentemente, il test di crioemolisi,16,17 basato sull’osservazione che i globuli rossi di pazienti con sferocitosi ereditaria sono particolarmente sensibili al raffreddamento a 0° C in condizioni ipertoniche, e l’analisi citometrica a flusso di globuli rossi intatti marcati con eosina-5′-maleimide (EMA-binding test)18 sono stati proposti come nuovi metodi per identificare la sferocitosi ereditaria.19 Quest’ultimo in particolare ha dimostrato di essere un test diagnostico sensibile e specifico per la sferocitosi ereditaria12,18,20-29 che punta direttamente alla lesione strutturale di questa malattia, poiché la sonda fluorescente, eosina-5′-maleimide, interagisce con il complesso proteico della banda 3.30

La performance dei test diagnostici diretti o indiretti disponibili è stata per lo più valutata individualmente e su un numero limitato di casi. La sensibilità del test varia notevolmente e ogni metodo non riesce a identificare diversi pazienti con sferocitosi ereditaria.4,6,12 In questo studio, abbiamo confrontato le prestazioni dei test EMA-binding, della fragilità osmotica indotta da NaCl del sangue fresco e incubato, GLT, AGLT e Pink su una serie di 150 pazienti con sferocitosi ereditaria raggruppati secondo il fenotipo clinico e la lesione molecolare, con lo scopo finale di trovare la combinazione di test associata al più alto potere diagnostico per la sferocitosi ereditaria, compresi i casi più lievi che sono solitamente difficili da diagnosticare.

Progettazione e metodi

Soggetti

Sono stati studiati centocinquanta pazienti consecutivi con sferocitosi ereditaria (79 maschi e 71 femmine, età mediana 26 anni, range 0-79 anni) appartenenti a 128 famiglie non imparentate. Al momento dello studio, 22 pazienti erano splenectomizzati e 128 non splenectomizzati.

Tutti i pazienti sono stati sottoposti a valutazione clinica e fisica e ai seguenti esami di laboratorio: emocromo completo, esame dello striscio di sangue, conta dei reticolociti, dosaggio della bilirubina e della concentrazione di aptoglobina, valutazione dello stato del ferro, test antiglobulina diretto (DAT), screening delle emoglobine anormali o instabili, test di fragilità osmotica NaCl su sangue fresco e incubato, GLT, AGLT, test rosa e test EMA-binding. In alcuni casi, è stata studiata l’attività dei più importanti enzimi glicolitici e della via del pentoso fosfato. In alcuni pazienti è stato eseguito anche il DAT31 stimolato da mitogeni per escludere la diagnosi di anemia emolitica DAT-negativa.

La sferocitosi ereditaria è stata diagnosticata sulla base di segni clinici e di laboratorio di emolisi cronica, presenza di sferociti all’esame dello striscio di sangue periferico, positività di almeno un test di fragilità dei globuli rossi, storia familiare di sferocitosi ereditaria se presente, ed esclusione di altre cause di sferocitosi secondaria.19 L’anemia è stata definita come grave (Hb<8 g/dL), moderata (Hb 8-10 g/dL), lieve (Hb>10 e <11,5 g/dL per le donne e Hb>10 e <13,5 g/dL per i maschi) e compensata (Hb>11,5 g/dL per le donne e >13,5 g/dL per i maschi).

I campioni di tutti i pazienti sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE) per l’analisi delle proteine di membrana dei globuli rossi e suddivisi a seconda che ci fosse carenza di banda 3, spectrina o ankyrin, carenza combinata di spectrina/ankyrin e nessun difetto rilevabile.4

Cinquecentosettantacinque donatori di sangue sani e 84 casi con anemia emolitica diversa dalla sferocitosi ereditaria (17 con anemia emolitica autoimmune, 10 con disturbi enzimatici dei globuli rossi, 10 con elliptocitosi ereditaria, 15 con anemia diseritropoietica congenita, 9 con emoglobinuria parossistica notturna, 3 con stomatocitosi, 3 con anemia meccanica e 17 con anemia di causa sconosciuta).

Saggi ematologici

Il sangue periferico è stato raccolto dai pazienti e dai controlli durante le procedure diagnostiche dopo aver ottenuto il consenso informato e l’approvazione del comitato istituzionale per la ricerca umana. Le procedure seguite erano conformi alle norme etiche internazionali di Helsinki sulla sperimentazione umana. La maggior parte dei campioni è stata raccolta nel nostro istituto; i campioni raccolti da altri centri sono stati spediti mantenendo una temperatura di 4°C e sempre processati entro 24 ore. Nessuno dei pazienti era stato trasfuso nei 3 mesi precedenti lo studio. I parametri ematologici sono stati determinati su un analizzatore ematologico automatizzato (Automatic Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Le indagini ematologiche di routine sono state eseguite secondo Dacie & Lewis.32 I livelli di bilirubina, aptoglobina e ferritina sono stati determinati utilizzando Integra 800 (Roche, Mannheim, Germania). Il numero di sferociti nel sangue periferico è stato valutato da due operatori indipendenti ed esperti. La fragilità osmotica dei globuli rossi è stata valutata eseguendo il test di fragilità osmotica NaCl sia su sangue fresco che incubato,6 la GLT standard,7 l’AGLT8 e il Pink test9 su campioni di ciascun paziente.

Il test di legame EMA è stato eseguito come descritto da King et al.18 con piccole modifiche. In particolare, l’intensità di fluorescenza, espressa come fluorescenza mediana del canale, è stata determinata per 10.000 eventi nel canale FL-1, utilizzando un citometro a flusso Becton Dickinson FACSCanto II (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). La soluzione stock del colorante EMA è stata conservata in piccole aliquote a -80° C per un periodo di 6 mesi. Il test è stato eseguito una volta alla settimana raggruppando tutti i casi nello stesso giorno25 dopo aver confermato la riproducibilità dei risultati su campioni di sangue conservati fino a 6 giorni a 4°C.

Al fine di ridurre la variazione intra-test, i campioni dei pazienti sono stati confrontati con quelli di sei controlli normali. I risultati sono stati espressi come percentuale di riduzione della fluorescenza del campione del paziente rispetto alla fluorescenza media dei sei controlli normali, come proposto da Girodon et al.25 È stata utilizzata una curva ROC (receiver operating characteristic) basata sull’analisi di regressione logistica per determinare il cut-off ottimale tra i valori dei pazienti con sferocitosi ereditaria e quelli degli individui normali. Secondo l’analisi della curva ROC, la diminuzione ottimale della fluorescenza per separare i soggetti normali dai pazienti con sferocitosi ereditaria era dell’11%. In queste condizioni la specificità del test calcolata su 575 soggetti sani è stata del 98%.

I fantasmi delle cellule rosse sono stati preparati entro 24 ore dalla raccolta del sangue usando il metodo descritto da Dodge et al.33 con leggere modifiche.4 Le proteine di membrana delle cellule rosse sono state analizzate entro 15 giorni dalla preparazione dei fantasmi mediante SDS-PAGE usando un gradiente di acrilammide dal 4% al 12% secondo Fairbanks et al.34 e il sistema a tampone discontinuo di Laemmli35 con un gradiente lineare di acrilammide dal 6% al 14%, come precedentemente descritto.4 Le attività degli enzimi delle vie glicolitiche e del pentoso fosfato sono state valutate con i metodi descritti da Beutler.36

Risultati

La tabella 1 mostra i dati ematologici e biochimici dei pazienti con sferocitosi ereditaria raggruppati a seconda che non fossero stati splenectomizzati o fossero stati splenectomizzati prima del tempo dello studio, e secondo il fenotipo clinico (solo nei pazienti non splenectomizzati). La maggior parte dei soggetti non splenectomizzati aveva un’emolisi da lieve a compensata; il 18% aveva pochissimi sferociti (≤3%). Le anomalie proteiche più comuni erano carenze di spettrina e banda 3 sia nei pazienti non splenectomizzati che in quelli splenectomizzati. Il difetto della proteina di membrana non era rilevabile in nove (7%) soggetti non splenectomizzati, sette dei quali avevano una storia familiare positiva di sferocitosi ereditaria; i restanti due mostravano anemia lieve, reticolocitosi e 5% sferociti, in assenza di altre cause di anemia emolitica cronica.

La tabella 2 confronta la sensibilità dei test diagnostici di laboratorio per la sferocitosi ereditaria. L’EMA-binding non è riuscito a identificare 10/150 (7%) casi (4 con deficit di banda 3, 5 con deficit di spectrina e 1 con un difetto non rilevato). La diminuzione media della fluorescenza era del 27% ± 10% nei pazienti con sferocitosi ereditaria contro lo 0 % ± 8% nei soggetti di riferimento (P<0,001). La riduzione percentuale della fluorescenza era direttamente correlata al numero di sferociti e indirettamente al volume corpuscolare medio; nessuna correlazione è stata trovata con la concentrazione di emoglobina, il numero assoluto di reticolociti o la larghezza della distribuzione dei globuli rossi. La sensibilità del test era indipendente dal tipo e dall’entità del difetto molecolare, anche se era leggermente inferiore nei pazienti con difetti non rilevati che avevano la più piccola diminuzione mediana della fluorescenza (15% contro 30% e 28% nel deficit di banda 3 e spettrina, rispettivamente). Vale la pena notare che la sensibilità del test di legame all’EMA era leggermente più alta nei pazienti splenectomizzati che in quelli non splenectomizzati (Figura 1).

La sensibilità dei vari test di fragilità dei globuli rossi studiati era molto variabile e generalmente più alta nei pazienti splenectomizzati che in quelli non splenectomizzati con sferocitosi ereditaria, e più bassa (ad eccezione di AGLT) nei pazienti con difetti non rilevati che in quelli con difetti rilevabili (Tabella 2A). Per quanto riguarda il test di fragilità osmotica NaCl, la sensibilità era maggiore quando eseguito su sangue incubato che su sangue fresco. Nel complesso, i test di fragilità osmotica NaCl (sia su sangue fresco che incubato) avevano una sensibilità inferiore rispetto ai test più comunemente usati a base di glicerolo. Tra questi ultimi test, l’AGLT aveva la sensibilità più alta, anche nei casi con difetti non rilevati, paragonabile a quella del test EMA-binding.

Tabella 1.Dati ematologici e biochimici dei pazienti con sferocitosi ereditaria raggruppati in base al fatto che fossero stati o meno splenectomizzati.

Tutti i pazienti con sferocitosi ereditaria erano positivi ad almeno due diversi test con l’eccezione di due pazienti (1 con deficit di banda 3 e 1 con deficit di spectrina) che erano positivi solo al test EMA-binding. Abbiamo trovato che la combinazione di EMA e AGLT ha permesso di identificare tutti i pazienti con sferocitosi ereditaria (Tabella 2B). In particolare, 133/150 (88%) dei casi di sferocitosi ereditaria erano EMA-positivi, AGLT-positivi, 7/150 (5%) erano EMA-positivi, AGLT-negativi e 10/150 (7%) erano EMA-negativi, AGLT-positivi.

Quando la performance dei vari test è stata analizzata in pazienti non splenectomizzati in funzione del fenotipo clinico, l’EMA-binding, l’AGLT e il Pink test hanno mantenuto un’alta sensibilità nei diversi sottoinsiemi clinici, mentre la sensibilità del test di fragilità osmotica NaCl su sangue fresco e dopo incubazione è scesa notevolmente nei casi compensati (Figura 1).

I risultati di vari test in una serie di 84 pazienti con condizioni emolitiche diverse dalla sferocitosi ereditaria sono rappresentati nella Figura 2. L’EMA-binding ha mostrato la maggiore specificità della malattia risultando negativo in tutti i pazienti con anemia emolitica autoimmune, anche in presenza di sferocitosi marcata.

Discussione

Questo è il primo ampio studio di confronto dei metodi di laboratorio attualmente più utilizzati per la diagnosi di sferocitosi ereditaria, effettuato su un gran numero di pazienti raggruppati in base al difetto molecolare, al grado di emolisi e alla presenza o assenza della milza. La constatazione che la metà dei pazienti esaminati aveva un’anemia lieve/compensata ed era, quindi, più difficile da diagnosticare, e che il 18% aveva pochissimi sferociti sullo striscio di sangue periferico, rende la popolazione esaminata particolarmente adatta agli studi di sensibilità. Non abbiamo incluso il test di crioemolisi17 in questo studio poiché la base della suscettibilità dei globuli rossi della sferocitosi ereditaria al raffreddamento non è stata finora chiarita e le opinioni sul suo utilizzo di routine per la diagnosi della sferocitosi ereditaria sono controverse.4,5,16,17,19,37,38

Tabella 2. (A) Sensibilità dei singoli test nei pazienti con sferocitosi ereditaria (HS) raggruppati secondo il difetto biochimico. (B) La sensibilità dei test combinati nel totale dei casi di HS. Il numero rappresenta il rapporto casi positivi/casi totali con valori percentuali tra parentesi.

Figura 1. Sensibilità di vari test diagnostici in 22 pazienti splenectomizzati e 128 non splenectomizzati con sferocitosi ereditaria (HS). I pazienti non splenectomizzati con HS sono stati divisi in base al fenotipo clinico.

Tra i metodi diagnostici considerati, il test EMA-binding recentemente proposto è sicuramente il più interessante, ed è sempre più utilizzato dai laboratori specializzati per la sua alta sensibilità e specificità.12,18,23-29 Questo metodo punta direttamente alla lesione strutturale della malattia, poiché la sonda fluorescente eosina-5′-maleimide interagisce con le proteine transmembrana banda 3, la proteina Rh, la glicoproteina Rh e il CD47 che sono ridotte nei globuli rossi dei pazienti con sferocitosi ereditaria;30 difetti di altre proteine citoscheletriche, come la spectrina e la proteina 4.2, inducono anche una diminuzione dell’intensità della fluorescenza, probabilmente perché creano un effetto di modulazione a lungo raggio sul sito di legame del colorante nella proteina della banda 3.39 La sensibilità del test di legame all’EMA in questa serie è superiore a quella recentemente riportata da Crisp et al.,12 e simile a quella trovata da altri;18,23-29 inoltre, la performance del test sembra essere indipendente dal tipo di deficit della proteina di membrana dei globuli rossi, e diminuisce solo leggermente nei pazienti con sferocitosi ereditaria con un difetto non rilevabile, in linea con quanto osservato da King et al.,18 e Girodon et al.25 È interessante notare che la sensibilità è indipendente dal fenotipo clinico, essendo elevata anche nei pazienti con anemia compensata. L’analisi separata di pazienti non splenectomizzati e splenectomizzati con sferocitosi ereditaria ha mostrato che la sensibilità è aumentata in quest’ultimo gruppo, un risultato generalmente comune a tutti i test studiati; questa osservazione evidenzia la necessità di definire con precisione le caratteristiche cliniche dei pazienti quando si testa la performance dei metodi diagnostici per la sferocitosi ereditaria, e possibilmente di limitare l’analisi ai soggetti non splenectomizzati. Un ulteriore vantaggio del test EMA-binding è che i risultati non sono influenzati dalla spedizione o dalla conservazione fino a 6 giorni, come mostrato nella Figura 3, permettendo così la spedizione di campioni come riportato da Girodon et al.25 Inoltre, i risultati non sono influenzati da trasfusioni recenti poiché il metodo discrimina diverse popolazioni di globuli rossi.20

Figura 2.Risultati dei singoli test diagnostici in pazienti con anemie emolitiche diverse dalla sferocitosi ereditaria (HS), rispetto a quelli con HS. L’area ombreggiata rappresenta gli intervalli di riferimento normali. CDA: anemia diseritropoietica congenita; AIHA: anemia emolitica autoimmune; HE: elliptocitosi ereditaria; PNH: Paroxysmal noctural hemoglobinuria

Per quanto riguarda i test di fragilità osmotica NaCl, abbiamo trovato che questi non sono riusciti a identificare quasi un quarto dei pazienti con sferocitosi ereditaria, confermando i risultati di altri ricercatori,12,13,19,40,41 e che la loro sensibilità era generalmente inferiore a quella degli altri test diagnostici di laboratorio valutati in questa serie. Nonostante ciò, la fragilità osmotica NaCl incubata è ancora comunemente considerata il gold standard per la diagnosi di sferocitosi ereditaria nei pazienti con anemie emolitiche Coombs-negative.5,11,42 In effetti, l’analisi della letteratura rivela che in passato non sono stati eseguiti studi sistematici sulla sensibilità di questo test e che l’affermazione che sia il miglior metodo per la diagnosi di sferocitosi ereditaria si basa su studi effettuati su un numero limitato di pazienti con caratteristiche cliniche non chiaramente definite; inoltre, l’interpretazione delle curve di fragilità osmotica NaCl può essere difficile nei casi meno tipici.8 L’elevato numero di pazienti considerati in questa serie ci ha permesso di correlare la performance del test di fragilità osmotica NaCl con l’espressione clinica della malattia: l’osservazione che nei casi di sferocitosi ereditaria compensata la sensibilità dei test di fragilità osmotica è scesa a quasi il 60%, molto più di quanto riportato da Korones & Pearson,13 limita ulteriormente l’utilità di questo metodo nei casi più lievi e meno tipici. Ciò è confermato anche dalla constatazione che la sensibilità scende al 30% nei pazienti con sferocitosi ereditaria con un difetto biochimico non rilevabile.

I test di fragilità dei globuli rossi a base di glicerolo, ad eccezione della versione originale GLT, sono più sensibili del test di fragilità osmotica NaCl; in particolare, in questa serie, l’AGLT aveva una sensibilità del 95%, simile a quella trovata da altri1,15,43,44 e superiore a quella riportata da Cynober et al.10 e Bucx et al.45 La sensibilità dell’AGLT era alta anche nei casi compensati e in quelli con un difetto biochimico non rilevato. Inoltre, vale la pena notare che l’AGLT ha identificato i dieci casi EMA-negativi di sferocitosi ereditaria.

L’associazione dell’EMA-binding e dell’AGLT ha permesso di identificare tutti i casi di sferocitosi ereditaria in questa serie; poiché il citometro a flusso non è disponibile in tutti i laboratori diagnostici, vale la pena ricordare che l’AGLT più il test di fragilità osmotica NaCl su sangue incubato alza la sensibilità diagnostica al 97%, simile a quella precedentemente riportata in una serie più ampia di pazienti4: in ogni caso, questo valore è superiore a quello ottenuto combinando l’EMA-binding e il test di crioemolisi, come recentemente riportato da Crisp et al.12

Figura 3.(A) Valori medi di fluorescenza del canale nei controlli normali e nei pazienti con sferocitosi ereditaria (HS) a diversi giorni di conservazione. (B-C) Risultati del test di legame all’EMA in campioni di 150 pazienti HS raggruppati in base alla spedizione (B) e ai giorni di conservazione prima del test (C). ■ Controlli, – HS non spedito, ○ HS spedito.

Figura 4.Diagramma di flusso per la diagnosi di laboratorio della sferocitosi ereditaria (HS).

La specificità della malattia dei test diagnostici per la sferocitosi ereditaria è stata valutata includendo un ampio gruppo di pazienti con diversi tipi di anemia emolitica che possono mostrare caratteristiche morfologiche e di laboratorio simili a quelle della sferocitosi ereditaria. Come previsto, i risultati di EMA-binding, in termini di riduzione percentuale della fluorescenza, erano direttamente correlati al numero di sferociti solo nei pazienti con sferocitosi ereditaria, ma non nei pazienti con anemia emolitica autoimmune, anche in quelli con sferocitosi marcata: questa osservazione è in linea con l’alta specificità della malattia di questo test riportata da altri.19-21,25 Abbiamo trovato che gli altri test, in particolare quelli a base di glicerolo, sono meno specifici dell’EMA-binding, poiché, come riportato in precedenza,8,9,14,15,46 sono spesso positivi anche nelle anemie emolitiche acquisite. Vale la pena ricordare che nessuno dei test diagnostici disponibili per la sferocitosi ereditaria, sia diretti che indiretti, differenzia la sferocitosi ereditaria dall’anemia diseritropoietica congenita di tipo II. Quest’ultimo disordine, anche se meno prevalente della sferocitosi ereditaria, può imitare la presentazione clinica, la morfologia dei globuli rossi e l’aumentata fragilità osmotica dei globuli rossi della sferocitosi ereditaria e può richiedere l’analisi SDS-PAGE per essere identificato: Mariani et al. hanno riferito che il 13% dei casi riferiti a un laboratorio di riferimento con l’etichetta provvisoria di sferocitosi ereditaria sono risultati essere anemia diseritropoietica congenita di tipo II quando esaminati con SDS-PAGE.47

Le linee guida diagnostiche per la sferocitosi ereditaria del British Committee for Standards in Hematology,19 le uniche finora disponibili, raccomandano o l’EMA-binding o il test di crioemolisi come metodo di screening,16 il fattore decisivo per la scelta è la disponibilità di un citometro a flusso. Le linee guida non specificano se, in caso di risultati equivoci o borderline, debbano essere eseguiti entrambi i test. In ogni caso, anche l’associazione di questi due test dà una sensibilità del 93%, simile a quella dell’EMA-binding o dell’AGLT usati da soli, e molto inferiore a quella ottenuta dalla combinazione di EMA-binding più AGLT.

Come si vede nella Figura 4, in presenza di un paziente con emolisi cronica DAT-negativa con sferociti, la negatività di entrambi gli EMA e AGLT permette di escludere la sferocitosi ereditaria. La positività dell’EMA-binding (con un AGLT positivo o negativo) porta alla diagnosi di sferocitosi ereditaria, tranne in quei casi non dominanti con reticolocitosi inadeguata11 che necessitano di analisi SDS-PAGE per escludere l’anemia diseritropoietica congenita di tipo II. L’analisi SDS-PAGE può anche essere richiesta nei rari casi EMA-negativi, AGLT-poistive con una storia familiare negativa, a causa della minore specificità della malattia di AGLT.

In conclusione, nessun singolo test è in grado di identificare tutti i casi di sferocitosi ereditaria. L’associazione di EMA-binding, che mira direttamente al difetto strutturale della sferocitosi ereditaria, e AGLT, che sfrutta il rapporto area superficiale dei globuli rossi-volume, ci ha permesso di identificare tutti i pazienti con sferocitosi ereditaria in questa serie e, quindi, rappresenta una strategia diagnostica molto efficace per la sferocitosi ereditaria anche nei casi lievi/compensati. Tuttavia, va sottolineato che la diagnosi di sferocitosi ereditaria è il passo finale di un work-up diagnostico basato non solo su test di laboratorio ma anche sull’esame clinico, sulla storia familiare personale e sull’esclusione di possibili cause di sferocitosi secondaria.

Footnotes

• Finanziamento: questo lavoro è stato supportato da un grant della Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, RC2009 160/01 e dal progetto ENERCA III, CE 2008, convenzione n. 210.
• Authorship and DisclosuresLe informazioni fornite dagli autori sui contributi delle persone elencate come autori e nei ringraziamenti sono disponibili insieme al testo completo di questo articolo su www.haematologica.org.
• Le informazioni finanziarie e di altro tipo fornite dagli autori utilizzando il formato uniforme ICMJE (www.icmje.org) per la divulgazione degli interessi concorrenti sono disponibili anche su www.haematologica.org.

• Ricevuto il 4 agosto 2011.
• Revisione ricevuta l’11 ottobre 2011.
• Accettato il 26 ottobre 2011.

1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalenza di una maggiore fragilità osmotica degli eritrociti nei donatori di sangue tedeschi: screening utilizzando un test di lisi del glicerolo modificato. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
2. Tse WT, Lux SE. Disturbi della membrana dei globuli rossi. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
3. Gallagher PG. Disturbi della membrana dei globuli rossi. Ematologia Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Caratteristiche cliniche ed ematologiche di 300 pazienti affetti da sferocitosi ereditaria raggruppati secondo il tipo di difetto della proteina di membrana. Ematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
5. Ematologia dell’infanzia e dell’adolescenza. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. La resistenza osmotica (fragilità) dei globuli rossi umani. J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
7. Gottfried EL, Robertson NA. Tempo di lisi con glicerolo di eritrociti incubati nella diagnosi di sferocitosi ereditaria. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: a screening test for spherocytosis. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. Un nuovo test per la diagnosi di laboratorio della sferocitosi. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Anomalie delle cellule rosse nella sferocitosi ereditaria: rilevanza per la diagnosi e comprensione dell’espressione variabile della gravità clinica. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Sferocitosi ereditaria. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. Uno studio prospettico per valutare il valore predittivo della sferocitosi ereditaria utilizzando cinque test di laboratorio (test di crioemolisi, citometria a flusso eosina-5′-maleimide, test di fragilità osmotica, test di autoemolisi e SDS-PAGE) su 50 famiglie di sferocitosi ereditaria in Argentina. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
13. Korones D, Pearson HA. Normale fragilità osmotica degli eritrociti nella sferocitosi ereditaria. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Valore diagnostico del test di lisi con glicerolo acidificato (AGLT) nella sferocitosi ereditaria e nelle malattie ematologiche selezionate. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. Nuovi test per la diagnosi di laboratorio della sferocitosi. Vnitr Lek. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Cryohemolysis test come strumento diagnostico per sferocitosi ereditaria. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
17. Streichman S, Gescheidt Y. Crioemolisi per la rilevazione della sferocitosi ereditaria: studi di correlazione con la fragilità osmotica e autoemolisi. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Rapid flow cytometric test per la diagnosi di membrana citoscheletro-associato anemia emolitica. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Linee guida per la diagnosi e la gestione della sferocitosi ereditaria. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Using the eosin-5-maleimide binding test in the differential diagnosis of hereditary spherocytosis and hereditary pyropoikilocytosis. Citometria B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. La proteina eritrocitaria mutante della banda 3 nella ovalocitosi del sud-est asiatico non lega l’eosina-5-maleimide. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Rilevazione di pyropoikilocytosis ereditario da eosina-5-maleimide (EMA)-binding test è attribuibile ad una marcata riduzione delle proteine transmembrana EMA-reattiva. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Esperienza con eosina-5′-maleimide come strumento diagnostico per i disturbi del citoscheletro della membrana delle cellule rosse. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Citometria a flusso come strumento diagnostico per la sferocitosi ereditaria. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Utilità del metodo citometrico eosina-5′-maleimide come test di screening di prima linea per la diagnosi di sferocitosi ereditaria: confronto con ektacytometry e elettroforesi delle proteine. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Valutazione del test citometrico a flusso di eosina-5-maleimide nella diagnosi di sferocitosi ereditaria. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Diagnostica citometrica a flusso della sferocitosi ereditaria. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. Affidabilità del test EMA binding nella diagnosi di sferocitosi ereditaria in pazienti italiani. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Rapid flow cytometric test using eosin-5-maleimide for diagnosis of red blood cell membrane disorders. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosina-5-maleimide legame alla banda 3 e Rh-proteine correlate costituisce la base di un test di screening per sferocitosi ereditaria. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. Quantificazione in vitro della produzione di anticorpi anti globuli rossi nell’anemia emolitica idiopatica autoimmune: effetto della stimolazione con mitogeni e citochine. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
32. Dacie JV, Lewis SM. Ematologia pratica. Churchill Livingston: Londra; 2001. Google Scholar
33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. La preparazione e le caratteristiche chimiche dei fantasmi senza emoglobina di eritrociti umani. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Analisi elettroforetica dei principali polipeptidi della membrana eritrocitaria umana. Biochimica. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
35. Laemmli UK. Scissione di proteine strutturali durante l’assemblaggio della testa del batteriofago T4. Natura. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
36. Beutler E. Metabolismo delle cellule rosse: un manuale di metodi biochimici. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
37. Iolascon A, Avvisati RA. Correlazione genotipo/fenotipo nella sferocitosi ereditaria. Ematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Utilità del test di crioemolisi nella diagnosi di sferocitosi ereditaria. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Controllo della mobilità laterale e rotazionale della banda 3 da parte della banda 4.2 in eritrociti intatti: rilascio di oligomeri della banda 3 da siti di legame a bassa affinità. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. La preincubazione dei globuli rossi contribuisce alla capacità del test di fragilità osmotica di rilevare forme molto lievi di sferocitosi ereditaria? Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
41. Ematologia pratica. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Esperienza con il test di glicerolo lisi in mezzo acido nella diagnosi di sferocitosi ereditaria. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Utilità diagnostica del test di lisi pre-incubato con glicerolo acidificato nelle anemie emolitiche e non emolitiche. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Confronto tra il test di lisi con glicerolo acidificato, il test di Pink e il test di fragilità osmotica nella sferocitosi ereditaria: effetto dell’incubazione. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. Una valutazione del test di lisi con glicerolo acidificato. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Anemia diseritropoietica congenita tipo II (CDA II) che imita la sferocitosi ereditaria (HS): rapporto di 12 casi rilevati da SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar