L’analisi delle molecole chiave del sistema endocannabinoide (EC) 2-arachidonoil glicerolo (2AG) e l’arachidonoil etanolamide (anandamide, AEA) è impegnativa a causa di diverse peculiarità. Il 2AG isomerizza spontaneamente al suo analogo biologicamente inattivo 1-arachidonoil glicerolo (1AG) per migrazione acilica ed è distinguibile solo cromatograficamente dal 1AG. Gli effetti di matrice causati principalmente dai fosfolipidi co-estratti possono compromettere ulteriormente l’analisi. Inoltre, 2AG e 1AG sono instabili in certe condizioni come l’evaporazione del solvente o la ricostituzione di estratti secchi. Abbiamo esaminato gli effetti di diversi solventi organici e delle loro miscele, come toluene, acetato di etile e cloroformio-metanolo, sull’isomerizzazione 2AG/1AG, sulla stabilità 2AG/1AG e sugli effetti della matrice nell’analisi UPLC-MS/MS di 2AG e AEA nel plasma umano. Il toluene ha impedito sia l’isomerizzazione del 2AG in 1AG che la degradazione del 2AG/1AG durante l’evaporazione. Gli estratti di toluene contengono solo il 2% dei fosfolipidi plasmatici che causano l’effetto matrice rispetto agli estratti della miscela di solventi tradizionalmente usata cloroformio-metanolo. Il toluene e tutti gli altri solventi organici testati forniscono rese di estrazione di 2AG e AEA comparabili (60-80%). Sulla base di queste proprietà favorevoli del toluene, abbiamo sviluppato e convalidato un metodo UPLC-MS/MS con ionizzazione elettrospray positiva (ESI+) che permette la misurazione simultanea accurata e precisa di 2AG e AEA nel plasma umano. Il metodo UPLC-MS/MS è stato sottoposto a convalida incrociata con un metodo GC-MS/MS completamente convalidato precedentemente descritto per AEA nel plasma umano. È stata osservata una stretta correlazione (r(2)=0,821) tra i risultati ottenuti dai metodi UPLC-MS/MS (y) e GC-MS/MS (x) (y=0,01+0,85x). Il metodo UPLC-MS/MS è adatto alla misurazione di routine di 2AG e AEA in campioni di plasma umano (1 mL) in ambito clinico, come dimostrato da campioni di plasma per il controllo di qualità elaborati per un periodo di 100 giorni. Il metodo UPLC-MS/MS è stato ulteriormente esteso alle urine umane. Nelle urine, l’AEA non era rilevabile e il 2AG è stato rilevato solo in 3 dei 19 campioni di soggetti sani a 160, 180 e 212 pM corrispondenti a 12,3, 14,5 e 9,9 pmol/mmol di creatinina, rispettivamente.