Regolazione dell’acetato e dell’acetil-CoA durante la crescita su acetato e/o glucosio nell’archeo alofilo Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui forma acetato durante la crescita aerobica su glucosio e utilizza l’acetato come substrato di crescita. Su miscele di glucosio/acetato è stata osservata una crescita diauxica con il glucosio come substrato preferito. È stata analizzata la regolazione delle attività enzimatiche relative al metabolismo del glucosio e dell’acetato. È stato trovato che sia la glucosio deidrogenasi (GDH) che l’acetil-CoA sintetasi formante ADP (ACD) sono state upregolate durante i periodi di consumo di glucosio e formazione di acetato, mentre sia l’acetil-CoA sintetasi formante AMP (ACS) che la malato sintetasi (MS) sono state downregolate. Al contrario, l’upregulation di ACS e MS e la downregulation di ACD e GDH sono state osservate durante i periodi di consumo di acetato. MS è stato anche upregolato durante la crescita su peptidi in assenza di acetato. Dai dati concludiamo che un ACD glucosio-inducibile catalizza la formazione di acetato mentre l’attivazione dell’acetato è catalizzata da un ACS acetato-inducibile; sia ACS che MS sono apparentemente indotti dall’acetato e repressi dal glucosio.

1 Introduzione

Vari archei alofili, tra cui Haloarcula marismortui, crescono sul glucosio, che viene degradato attraverso un percorso Entner-Doudoroff (ED) modificato e semifosforilato. È stato dimostrato che durante la crescita esponenziale su glucosio si formano quantità significative di acetato. Studi recenti indicano che la formazione di acetato da acetil-CoA in archei alofili è catalizzata da un’acetil-CoA sintetasi (ACD) che forma ADP (acetil-CoA + ADP + Pi⇆ acetato + ATP + CoA). Questa sintetasi insolita è stata trovata in tutti gli archei che formano acetato, compresi gli ipertermofili anaerobi, e rappresenta un nuovo meccanismo nei procarioti di formazione dell’acetato e di sintesi dell’ATP. Negli archaea ipertermofili anaerobici, per esempio Pyrococcus furiosus, ACD rappresenta la principale reazione di conservazione dell’energia durante il metabolismo dello zucchero, del piruvato e dei peptidi. In contrasto con il meccanismo mono-enzimatico degli archei, tutti i batteri usano il “classico” meccanismo a due enzimi per la conversione dell’acetil-CoA in acetato, coinvolgendo l’acetiltransferasi del fosfato (PTA) e l’acetato chinasi (AK).

Sono stati riportati diversi aloarchei, compresi H. marismortui, Haloferax volcanii e Halorubrum saccharovorum che crescono su acetato come substrato. Il metabolismo dell’acetato è iniziato dalla sua attivazione ad acetil-CoA. Recentemente, abbiamo fornito la prima prova che l’attivazione dell’acetato ad acetil-CoA negli aloarchei è catalizzata da un’acetil-CoA sintetasi (ACS) che forma AMP (acetato + ATP + CoA → acetil-CoA + AMP + PPi). L’ACS è il principale enzima di attivazione dell’acetato per la maggior parte degli organismi che utilizzano l’acetato in tutti e tre i domini della vita. Solo pochi batteri, ad esempio Corynebacterium glutamicum, e anche l’archeo metanogeno acetoclastico Methanosarcina ssp. attivano l’acetato in acetil-CoA attraverso la coppia AK/PTA. Così, la via AK/PTA può operare reversibilmente in vivo, cioè sia nella direzione della formazione dell’acetato che in quella dell’attivazione dell’acetato. Al contrario, le prime analisi suggeriscono che negli haloarchaea ACD, la controparte arcaica della coppia AK/PTA, opera in vivo nella direzione della formazione dell’acetato, anche se l’enzima catalizza una reazione reversibile in vitro.

Per chiarire ulteriormente il ruolo fisiologico e per ottenere le prime informazioni sulla regolazione dipendente dal substrato degli enzimi di conversione dell’acetato e dell’acetil-CoA negli aloarchei abbiamo condotto esperimenti di spostamento del substrato con H. marismortui, e analizzato la crescita su glucosio, acetato, miscele di glucosio/acetato e peptidi. Durante la crescita sono stati analizzati i profili di attività degli enzimi di conversione dell’acetato e dell’acetil-CoA, ACD e ACS, così come della glucosio deidrogenasi, il primo enzima nella degradazione del glucosio attraverso la via ED modificata. Inoltre, sono state determinate le attività della malato sintasi, un enzima chiave del ciclo del gliossilato, proposto per essere operativo negli haloarchaea.

2 Materiali e metodi

2.1 Crescita di H. marismortui su glucosio, acetato, miscele di glucosio/acetato e su peptidi

Haloarcula marismortui è stata coltivata aerobicamente a 37 °C su un terreno complesso contenente estratto di lievito, casaminoacidi e inoltre glucosio e/o acetato come descritto precedentemente. Per la crescita su miscela di glucosio/acetato questo mezzo è stato integrato con 12,5 mM di glucosio e 30 mM di acetato. La crescita sui peptidi è stata eseguita sul mezzo complesso in assenza di acetato e glucosio. Gli esperimenti di crescita sono stati eseguiti in fermentatori da 2 l (fairmen tec, Germania) con una velocità di agitazione di 500 rpm e un flusso di aria compressa di 600 ml al minuto. La crescita è stata seguita misurando la densità ottica a 578 nm (ΔOD578). Il ΔOD578 di 1 corrispondeva a un contenuto proteico di 0,5-0,6 mg/ml. Il glucosio e l’acetato sono stati determinati enzimaticamente come descritto in .

2.2 Preparazione degli estratti cellulari

A varie fasi di crescita le cellule di H. marismortui (100-200 ml della cultura) sono state raccolte e gli estratti cellulari sono stati preparati come descritto in . Le proteine sono state determinate con il metodo Bradford usando l’albumina di siero bovino come standard.

2.3 Determinazione delle attività enzimatiche

Tutti i saggi enzimatici sono stati eseguiti in condizioni aerobiche a 37 °C in cuvette riempite con 1 ml di miscela di saggio. Gli enzimi ausiliari sono stati generalmente aggiunti poco prima dell’inizio della reazione e ci si è assicurati che questi enzimi non fossero limitanti. Un’unità (1 U) di attività enzimatica è definita come 1 μmol di substrato consumato o prodotto formato al minuto.

• Acetil-CoA sintetasi (ADP-forming) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) è stata misurata come descritto in .

• Acetil-CoA sintetasi (AMP-forming) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) è stata monitorata come PPi e AMP dipendente HSCoA rilascio da acetil-CoA secondo Srere et al. con reagente tiolo di Ellman, 5′5-ditiobis (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB), misurando la formazione di anione tiofenolato a 412 nm (ε412 = 13,6 mM-1 cm-1). La miscela di analisi conteneva 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.25 M KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1 mM DTNB, 1 mM acetil-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi ed estratto.

• La malato sintasi (E.C. 4.1.3.2.) è stata monitorata in un saggio modificato secondo Serrano et al. con DTNB. La miscela del saggio conteneva 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0.1 mM DTNB, 0.2 mM acetil-CoA, 0.5 mM gliossilato ed estratto.

• La glucosio deidrogenasi (E.C. 1.1.1.47) è stata misurata secondo Johnsen et al. .

• L’acetato chinasi (E.C. 2.7.2.1.) è stata misurata come descritto in .

• La fosfotransacetilasi (E.C. 2.3.1.8.) è stata monitorata come rilascio di HSCoA dipendente dal Pi da acetil-CoA con DTNB . La miscela di saggio conteneva 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetil-CoA, 5 mM KH2PO4 ed estratto.

3 Risultati

Per studiare la funzione fisiologica e la regolazione degli enzimi legati al metabolismo dell’acetato e dell’acetil-CoA, cellule di H. marismortui pregrown on different substrates were moved to medium containing acetate and/or glucose and peptides, respectively, and activity profiles of ACD, ACS, GDH and MS were analyzed.

3.1 Growth of acetate-adapted cells on glucose

After a lag phase cells grew exponentially and glucose was completely consumed. Parallelamente al consumo di glucosio si sono formate quantità significative di acetato. In questo periodo le attività di GDH e ACD sono aumentate, mentre le attività di ACS e MS, che erano attive nelle cellule adattate all’acetato, sono state completamente ridotte. Nella fase stazionaria, l’acetato escreto è stato completamente riassorbito e le attività di ACS e MS sono aumentate, mentre le attività di GDH e ACD sono diminuite (Fig. 1).

3.2 Crescita di cellule glucosio-adattate su acetato

Le cellule glucosio-adattate sono cresciute inizialmente (circa 30 h) su un mezzo contenente acetato con un tempo di raddoppio di 10 h fino a una densità ottica (ΔOD578) di 1. In questa fase di crescita non è stato osservato alcun consumo di acetato e le cellule sono cresciute sui peptidi presenti nel mezzo. Dopo questo periodo, le cellule sono cresciute con un tasso di crescita ridotto fino a ΔOD578 di 1,8 e l’acetato è stato completamente consumato. Durante il consumo di acetato le attività ACD e GDH sono diminuite, mentre le attività ACS e MS, che non potevano essere rilevate nelle cellule adattate al glucosio, sono aumentate. L’aumento dell’attività MS è iniziato durante la crescita su peptidi, mentre l’aumento dell’attività ACS era parallelo al consumo di acetato (Fig. 2).

3.3 Crescita su miscele di glucosio/acetato

Cellule di H. marismortui adattate all’estratto di lievito e ai casaminoacidi sono state trasferite in un terreno contenente sia glucosio che acetato. Le cellule hanno mostrato una crescita diauxica con utilizzo sequenziale del primo glucosio e del secondo acetato. Nella prima fase di crescita le cellule sono cresciute fino a ΔOD578 di 4,0 e il glucosio è stato consumato. Dopo il consumo di glucosio e una breve fase di ritardo le cellule sono entrate nella seconda fase di crescita, in cui l’acetato è stato metabolizzato e le cellule sono cresciute fino a un ΔOD578 finale di 5,2. Nella prima fase di crescita parallela al consumo di glucosio le attività ACD e GDH sono aumentate, mentre l’attività ACS non poteva essere rilevata e l’attività MS era completamente downregolata. Nella seconda fase di crescita parallela all’utilizzo di acetato le attività ACS e MS sono aumentate e le attività ACD e GDH sono diminuite (Fig. 3).

3.4 Cellule adattate al glucosio su peptidi

Le cellule adattate al glucosio sono state spostate in un terreno contenente 0,25% di estratto di lievito e 0,5% di casaminoacidi in assenza di glucosio e acetato. Le cellule sono cresciute con un tempo di raddoppio di 13 ore fino a un ΔOD578 di 2,5. Non è stato possibile rilevare la formazione di acetato. Durante la crescita esponenziale ACD (da 60 a 20 mU/mg) e GDH (da 80 a 40 mU/mg) sono diminuiti, e l’attività MS, che inizialmente non poteva essere rilevata, è aumentata fino a 20 mU/mg. L’attività dell’ACS non è stata rilevata durante la fase di crescita esponenziale, ma è aumentata durante la fase stazionaria (13 mU/mg).

4 Discussione

In questo articolo abbiamo analizzato il ruolo fisiologico degli enzimi di conversione dell’acetato e dell’acetil-CoA (ACD, ACS) in H. marismortui e diamo la prima prova della regolazione specifica del substrato di questi enzimi, così come per GDH e MS. I dati sono discussi in confronto con i sistemi batterici conosciuti.

4.1 La formazione di acetato in H. marismortui è catalizzata da ACD come parte del metabolismo “overflow”

Durante la crescita su glucosio e su miscele di glucosio/acetato, sia le attività ACD che GDH sono aumentate parallelamente alle fasi di consumo di glucosio e formazione di acetato (Figg. 1 e 3). Al contrario, entrambe le attività sono diminuite durante la crescita su acetato o peptidi. Questi dati e l’assenza di AK/PTA indicano che la formazione di acetato in Haloarcula è catalizzata da ACD. Il ruolo fisiologico della formazione di acetato in H. marismortui e la sua regolazione durante la crescita aerobica su glucosio non è compreso; la formazione di acetato potrebbe essere parte di un metabolismo “overflow”, che è stato studiato in dettaglio in vari batteri, per esempio Escherichia coli e Bacillus subtilis. Come in H. marismortui, entrambi i batteri espellono l’acetato durante la crescita aerobica sul glucosio in eccesso e lo riutilizzano nella fase stazionaria. È stato ipotizzato che l’escrezione di acetato si verifica in condizioni quando il tasso di glicolisi supera quello delle vie successive, ad esempio, il ciclo dell’acido citrico e la respirazione necessaria per la completa ossidazione del glucosio. In queste condizioni l’acetil-CoA viene convertito in acetato ed escreto. In accordo con questo punto di vista, le analisi trascrizionali sia con E. coli che con B. subtilis indicano un’induzione glucosio-specifica dei geni glicolitici e la repressione dei geni del ciclo dell’acido citrico e della respirazione. Una simile regolazione trascrizionale specifica per il glucosio, cioè l’upregolazione dei geni glicolitici del percorso Entner-Doudoroff modificato, e la downregolazione di alcuni geni del ciclo dell’acido citrico e della respirazione è stata recentemente riportata per l’archetipo alofilo H. volcanii. Quindi, negli aloarchei è probabile un metabolismo di eccesso di glucosio specifico che porta alla formazione di acetato. La formazione di acetato in E. coli e B. subtilis coinvolge il meccanismo batterico a due enzimi tramite PTA e AK, mentre in Haloarcula la formazione di acetato è catalizzata da ACD, il meccanismo arcaico a un solo enzima. In entrambi, E. coli e B. subtilis, il glucosio è stato trovato per indurre i geni codificanti pta e ack che indicano una regolazione coordinata della glicolisi e della formazione di acetato. Finora, la regolazione trascrizionale dell’ACD che forma l’acetato nell’archeo H. marismortui non è stata analizzata. Tuttavia, la regolazione coordinata del GDH e dell’attività dell’ACD suggerisce una simile regolazione trascrizionale specifica per il glucosio sia della glicolisi attraverso la via modificata di Entner-Doudoroff che della formazione di acetato da parte dell’ACD.

Durante la crescita aerobica su peptidi H. marismortui non ha formato acetato e l’attività dell’ACD è stata downregolata. In questo senso Haloarcula differisce dal batterio E. coli, che forma quantità significative di acetato durante la crescita aerobica su peptidi nel corso di un metabolismo “overflow”. H. marismortui differisce anche dall’archeo anaerobico ipertermofilo P. furiosus e da altri archei anaerobici ipertermofili, che formano elevate quantità di acetato per mezzo di ACD durante la crescita anaerobica sia sugli zuccheri che sui peptidi. Durante la fermentazione anaerobica di peptidi e zuccheri di P. furiosus, la formazione di acetato da parte dell’ACD rappresenta il sito principale di formazione di ATP attraverso la fosforilazione a livello del substrato; al contrario, durante la degradazione aerobica di zuccheri e peptidi da parte di H. marismortui la maggior parte dell’energia è conservata dalla fosforilazione del trasporto di elettroni nella catena respiratoria e quindi la formazione di acetato da parte dell’ACD è meno importante o non necessaria. Così, la formazione di acetato da parte di ACD in Haloarcula sembra essere limitata al metabolismo degli zuccheri nel corso di un metabolismo “overflow”.

4.2 L’attivazione dell’acetato in acetil-CoA in H. marismortui è catalizzata da ACS

Questo è stato concluso dall’upregulation dell’attività ACS parallela al consumo di acetato (Figg. 1, 2, 3). Un ruolo dell’ACD nell’attivazione dell’acetato potrebbe essere escluso dal momento che l’ACD è stato downregolato durante i periodi di consumo di acetato. Così, l’ACD in Haloarcula opera in vivo solo in direzione della formazione di acetato. L’ACS è anche il meccanismo più comune di attivazione dell’acetato nei batteri dove è strettamente regolato; per esempio in E. coli e B. subtilis, il gene acs è indotto dall’acetato e represso dal glucosio. In Haloarcula, l’upregulation dell’attività ACS da parte dell’acetato e la downregulation da parte del glucosio suggeriscono una regolazione simile a livello trascrizionale come riportato per i batteri. Va notato che in contrasto con E. coli e B. subtilis, il batterio C. glutamicum attiva l’acetato tramite un percorso AK/PTA indotto dall’acetato.

L’attività di MS, un enzima chiave del ciclo del gliossilato, è stata aumentata durante i periodi di consumo di acetato in H. marismortui insieme a ACS suggerendo una regolazione coordinata acetato-specifica di ACS e del ciclo anaplerotico del gliossilato. Sia l’attività MS che ACS sono state regolate dal glucosio. L’induzione coordinata acetato-specifica dei geni degli enzimi di attivazione dell’acetato (vedi sopra) e della via del gliossilato è stata riportata per diversi batteri, compresi E. coli e C. glutamicum. Recentemente, la prima prova dell’induzione di entrambi i geni di malato sintasi e isocitrato liasi da parte dell’acetato è stata data per l’archeo alofilo H. volcanii.

Tuttavia, l’attività MS piuttosto che l’attività ACS è stata anche upregolata durante la crescita esponenziale su peptidi in assenza di acetato, indicando che la regolazione della MS è più complessa e non limitata all’acetato. Un ruolo della MS (e del ciclo del gliossilato) nel metabolismo dei peptidi potrebbe essere spiegato dal fatto che molti aminoacidi sono degradati in acetil-CoA, il che richiederebbe una via del gliossilato funzionale per l’anabolismo. L’aumento dell’attività ACS, osservato nella fase stazionaria durante la crescita sui peptidi, non può essere spiegato finora, potrebbe essere dovuto ad una risposta generale allo stress delle cellule della fase stazionaria.

4.3 Repressione del catabolita specifico del glucosio in H. marismortui

Haloarcula marismortui ha mostrato una crescita diauxica su miscele di glucosio/acetato con il glucosio come substrato preferito, indicando una sorta di repressione catabolica dell’utilizzo dell’acetato da parte del glucosio. La repressione catabolica specifica del glucosio non è stata finora analizzata negli archei. Nei batteri la base molecolare della repressione del catabolito del carbonio da parte del glucosio è stata studiata in dettaglio, per esempio in E. coli e B. subtilis. Durante la crescita di C. glutamicum su miscele di glucosio/acetato è stata descritta una crescita monofasica con consumo simultaneo di acetato e glucosio, mentre in Azotobacter vinelandii l’acetato è il substrato preferito. I principi di regolazione dietro queste caratteristiche sono attualmente studiati.

Sono necessari ulteriori studi per comprovare la proposta di regolazione specifica del substrato degli enzimi che formano e attivano l’acetato, ACD e ACS, in relazione al metabolismo dell’acetato e del glucosio a livello trascrizionale. Questi studi, che richiedono la purificazione e l’identificazione dei geni codificanti dell’ACD e dell’ACS da H. marismortui sono in corso.