Mentre i saggi proteici hanno una varietà di usi nella ricerca scientifica, non esiste un singolo metodo di saggio che sia adatto a tutte le applicazioni. Nonostante tutti i progressi della scienza moderna, non esiste un metodo di analisi delle proteine che non sia influenzato da componenti non proteici o dalle differenze nella composizione delle proteine. Per questo motivo, i laboratori di proteine trovano necessario avere più di un tipo di test delle proteine per le applicazioni di ricerca.
Ogni test ha i suoi vantaggi e limiti. Quindi, se vuoi ottenere risultati accurati dal tuo esperimento, dovresti essere in grado di selezionare il test più adatto alla tua applicazione.
Tipi di test colorimetrici delle proteine
In base alla chimica coinvolta, i due metodi più comuni per la rilevazione colorimetrica e la quantificazione delle proteine totali sono il test di legame proteina-tintura e/o il test di chelazione basato su ioni rame.
Saggi di legame del colorante
I saggi di legame del colorante, come il Bradford (Coomassie) e il 660nm protein assays, si basano sul legame delle molecole proteiche al colorante Coomassie in condizioni acide. Una volta che le molecole proteiche si legano al colorante, il colore passa dal marrone (Amax= 465nm) al blu (Amax= 610nm). Il cambiamento nella densità del colore (che si legge a 595nm) è proporzionale alla concentrazione della proteina.
Gli aminoacidi di base (arginina, lisina e istidina) giocano un ruolo vitale nella formazione dei complessi tintura-proteina e nel conseguente spostamento spettrale mentre le proteine più piccole (meno di 3kDa) e gli aminoacidi non producono cambiamenti di colore.
Saggi basati sugli ioni di rame
Nei saggi proteici basati sugli ioni di rame, la soluzione proteica viene mescolata con una soluzione alcalina di sale di rame per facilitare la chelazione degli ioni rameici (Cu2+) con i legami peptidici, e la successiva riduzione degli ioni rameici (Cu2+) a ioni rameici (Cu+). Qualsiasi eccesso di ioni rame rimarrà non legato ai legami peptidici e sarà disponibile per la rilevazione.
I saggi proteici basati sugli ioni rame possono essere divisi in due gruppi – (1) saggi che rilevano gli ioni rameici ridotti (Cu+) e (2) saggi che rilevano gli ioni rameici non legati (Cu2+). L’acido bicinchoninico (BCA) o il reagente Folin (acido fosfomolibdico/fosfotungstico) possono essere utilizzati per rilevare gli ioni rameici. Alla riduzione del reagente usato, viene prodotto un colore blu. La quantità di colore prodotta può essere letta a 650nm – 750nm ed è proporzionale alla quantità di legami peptidici.
Nota: La presenza di tirosina, triptofano, cisteina, istidina e asparginina nelle proteine aumenta la densità del colore risultante.
Nei saggi basati sulla rilevazione di ioni rameici non legati, il rame alcalino viene mescolato con la soluzione proteica e gli ioni rameici non legati vengono poi rilevati con un reagente che produce colore e reagisce con gli ioni rameici. La quantità di colore prodotta è inversamente proporzionale alla quantità di legame peptidico nel campione.
Selezione dei saggi sulle proteine: Alcuni fattori da considerare
Ci sono una serie di fattori che dovresti considerare quando scegli un test. Eccone alcuni.
- Compatibilità con il tipo di campione e i componenti. La natura del campione proteico e la presenza di agenti non proteici nelle soluzioni proteiche possono influenzare significativamente i risultati del vostro esperimento. Tenete a mente che la presenza di agenti riducenti, agenti chelanti dei metalli, coloranti, ammine e zuccheri interferisce con i saggi proteici a base di rame, mentre le soluzioni proteiche contenenti detergenti interferiscono con i saggi proteici a base di coloranti.
- Range di dosaggio e volume di campione richiesto. La maggior parte dei saggi colorimetrici richiede almeno 0,5 µg di proteine per una stima affidabile. Quindi, per i campioni difficili da ottenere, dovrebbero essere considerati i metodi che richiedono la minor quantità di campione per una stima affidabile.
- Uniformità da proteina a proteina. I saggi proteici basati sui coloranti e quelli che coinvolgono la riduzione degli ioni rameici a ioni rameici hanno una significativa variazione da proteina a proteina.
- Considerazioni sul tempo. La complessità del campione e il metodo di analisi scelto dettano la quantità di tempo necessaria per eseguire il dosaggio delle proteine. I campioni di proteine che contengono agenti interferenti e i saggi che utilizzano diagrammi o curve standard richiederanno più tempo.
- Requisiti della strumentazione. La disponibilità dello spettrofotometro o del lettore di piastre necessario per misurare il colore prodotto (assorbanza) dal saggio può anche influenzare la tua scelta.
