Sintesi e attività inibitoria di alcuni derivati della 4-idrossicumarina sulla proteasi HIV-1

Figura 5

L’aggiunta di Michael di 4-idrossicumarina e 3-(4-idrossi)fenilmetilene-2,4-pentanedione (6).

2.2. Docking molecolare

E’ stata studiata l’interazione della proteasi HIV-1 tramite docking molecolare con alcuni nuovi derivati 4-idrossicumarinici sintetizzati. I dati sperimentali per l’attività di alcune 4-idrossicumarine sono stati usati per il confronto.

Il docking molecolare preliminare è stato fatto sulla base di derivati noti di 4-idrossicumarina, che hanno attività inibitoria della proteasi HIV-1 (Tabella 1) . La griglia è scelta per sovradimensionare il ligando che è precedentemente legato all’enzima (in questo caso è stata scelta una dimensione di 7 Å della griglia).

I valori delle funzioni 𝐺-score ed E-model sono stati ottenuti con questo metodo. Sono chiamate funzioni di punteggio e sono equivalenti astratti di Δ𝐺bind. Queste funzioni tengono conto dell’energia libera dovuta agli effetti del solvente, dei cambiamenti conformazionali della proteina e del ligando, delle interazioni tra la proteina e il ligando (legami idrogeno, interazione ionica e forze di van der Waals), della perdita di energia libera di congelamento della rotazione interna della proteina e del ligando, della perdita di energia libera in energia traslazionale e rotazionale, causata dall’associazione delle due molecole, e dell’energia libera dovuta ai cambiamenti nel modo vibrazionale (solitamente ignorata). Se questi valori sono più negativi per un ligando, significa che la capacità di legame di questo ligando è migliore. Quando il ligando mostra capacità di legame in una determinata conformazione, il programma mostra questa come una “buona posa”.

Questo enzima consiste di due catene polipeptidiche e appartiene alla famiglia delle aspartil-proteasi con due residui di aspartato che si trovano alla base del sito attivo. Abbiamo usato la struttura cristallografica della proteasi retrovirale HIV-1, legata con un inibitore peptidomimetico BEA369 da Protein Data Bank con codice pdb 1EBY.

Si può concludere che il ligando (1) ha la più forte capacità di legame alla proteasi HIV-1. I risultati del docking molecolare confermano i dati sperimentali sul ligando (1).

Per quanto riguarda i ligandi (1)-(5), i valori di 𝐺-score ed E-model dal docking molecolare, per il gruppo di composti testati, sono mostrati nella tabella 2.

Le interazioni tra i derivati di 4-idrossicumarina studiati e i siti attivi dell’enzima HIV-1 proteasi sono realizzate dal legame idrogeno e dalle interazioni di van der Waals. Il composto più attivo per esempio, con la migliore attività di legame, è il composto (10), secondo i ligandi (1)-(4) (in base ai valori delle funzioni di punteggio). Questo fatto deriva probabilmente da una formazione di legami idrogeno tra l’atomo di ossigeno del pirano, l’ossigeno carbonilico del lattone e uno dei gruppi idrossilici (in metaposizione) attaccati all’anello aromatico dalla catena laterale. Anche le forze di attrazione di van der Waals contribuiscono a un buon legame. Secondo il ligando (5), il più attivo è il composto (7). Ci sono due legami idrogeno per il composto (7) con la partecipazione dell’atomo di ossigeno del pirano, dell’atomo di ossigeno carbonile dell’anello lattonico e di uno e dei corrispondenti frammenti di proteina. Le interazioni di attrazione di van der Waals, in cui probabilmente il gruppo m-nitro partecipa con uno dei suoi atomi di ossigeno sono sostanziali per il legame. Il composto (7) sembra essere più attivo dei ligandi sperimentali.

2.3. Attività biologica in coltura cellulare (cellule MT-4)

Dopo aver dimostrato l’attività di alcuni derivati 4-idrossicumarinici verso l’HIV-PR isolato in esperimenti di docking molecolare, sarebbe interessante testarli ulteriormente su cellule MT-4 infettate da HIV-1. La valutazione dell’effetto anti-HIV è stata fatta tramite un saggio di infezione in vitro rapido e sensibile in microtitolazione basato sulla quantificazione della citolisi tramite l’assorbimento del colorante vitale (MTT) come endpoint dell’infezione. Inoltre, l’effetto degli inibitori sull’attività endogena della trascrittasi inversa (RT) dei surnatanti MT-4 infettati da HIV-1 III B è stato considerato come un marcatore della capacità di bloccare la replicazione di HIV-1. Le cellule MT-4 sono state infettate e incubate con ogni inibitore per 72-96 ore, e poi l’attività RT è stata misurata nei surnatanti delle cellule secondo le linee guida del test HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Svezia). È stato anche eseguito uno studio dell’effetto diretto delle 4-idrossicumarine appena sintetizzate sulla RT esogena ricombinante (rRT). Inoltre, tutti i composti sono stati testati per l’attività anti-HIV-1 PR. La tabella 3 rappresenta i risultati del test di infezione in microtiter usando MTT e l’inibizione dell’attività di HIV-1 PR. Gli esperimenti sono stati eseguiti in concentrazione massima non tossica (MNC) per ogni composto.

Prima di tutto, si vede che i composti (8), (7), e (12) hanno MNC più alto che significa che sono più citotossici degli altri tre composti. Solo due di loro (10) e (7) hanno inibito la replicazione virale nelle cellule MT-4, l’inibizione indotta da (7) è stata notevole (78%). Usando diluizioni virali 10x, l’IC50 è stato stabilito essere 0,01 nM. Nessun composto ha mostrato effetto sia sulla RT endogena che su quella esogena. Questo significa che RT non era il bersaglio dell’azione antivirale. Come previsto dagli studi di docking molecolare, l’attività di HIV-1 PR è stata inibita del 24-25% da (7) (sono state fatte 5 valutazioni separate). La discordanza trovata per (7) tra i dati relativi all’inibizione dell’infettività (circa 75%) e l’attività proteasica (25%) potrebbe essere spiegata da un’altra attività, come quella anti-integrasi. È noto che alcuni derivati della 4-idrossicumarina sono inibitori dell’integrasi.

Gli esperimenti descritti in questo articolo espandono quelli precedentemente riportati che i derivati 4-idrossicumarinici potrebbero servire come nuovi PI nonpeptidici. Analogamente a tipranavir e darunavir, potrebbero essere efficaci nei pazienti con resistenza sviluppata ai PI peptidici. In particolare, (7) potrebbe essere utilizzato come farmacoforo per sintetizzare nuovi derivati più attivi verso la proteasi HIV-1.

3. Conclusione

Sei composti 4-idrossicumarini sono stati sintetizzati da una sintesi in due fasi. Il primo passo è la reazione di Knoevenagel tra aldeidi aromatiche e acetoacetato di etile o acetilacetone. Il secondo passo è l’aggiunta di Michael dell’arilmetilene-β-chetoestere o dell’arilmetilene-2,4-pentanedione ottenuto con la 4-idrossicumarina. I prodotti sono identificati e caratterizzati da 1H NMR, EI-MS, FTIR e analisi degli elementi.

Lo studio della loro attività di legame a HIV-1 PR è stato eseguito tramite docking molecolare. Il cristallo HIV-1 PR, legato con l’inibitore peptidomimetico BEA369, è stato utilizzato. La più alta attività di legame sta mostrando il composto (10), secondo i ligandi sperimentali (1), (2), (3) e (4) e il composto (7), secondo il ligando 5. Questo fatto è probabilmente dovuto alla formazione di legami idrogeno tra l’atomo di ossigeno del pirano, l’ossigeno carbonilico del lattone e uno dei gruppi idrossilici (in metaposizione) attaccati all’anello aromatico dalla catena laterale. Anche le forze di attrazione di van der Waals contribuiscono a un buon legame.

Tutti e sei i composti sono stati testati per l’attività anti-HIV-1 PR in cellule MT4 infettate da HIV-1. La sopravvivenza delle cellule è stata valutata con il test MTT ed è stata misurata anche la % di inibizione di HIV-1 PR. La più alta inibizione di HIV-1 PR (25%) e la più alta sopravvivenza delle cellule MT4 (78%) sono state dimostrate dal composto (7). Il composto (7) potrebbe essere ulteriormente usato come un farmacoforo per sintetizzare nuovi derivati più attivi verso HIV-1 PR.

4. Parte sperimentale

4.1. Sintesi dei derivati 4-Hydroxycoumarin

4.1.1. Materiali e metodi

Tutti i materiali di partenza sono stati acquistati da Merck, Sigma-Aldrich e Fluka. Sono utilizzati senza ulteriore purificazione. I punti di fusione sono stati misurati in tubi capillari aperti su un apparecchio per punti di fusione Büchi 535. Gli spettri IR sono stati registrati allo spettrometro Shimadzu FT-IR 8101 M in nujol, e le frequenze sono espresse in cm-1. Gli spettri 1H NMR sono stati registrati in Brucker 250 MHz in DMSO-d6 o acetone utilizzando TMS come standard interno (turni chimici sono riportati in unità ppm, costanti di accoppiamento (𝐽) in Hz). Le abbreviazioni sono le seguenti: s: singoletto, d: doppietto, dd: doppio doppietto, dq: doppio quartetto, dqui: doppio quintetto, t: tripletto, e m: multipletto.

L’analisi mass-spettrale è stata eseguita mediante ionizzazione elettronica su masspectrometer Hewlett-Packard 5973 a 70 eV.

4.1.2. Procedura generale per la preparazione di arilmetilene-β-chetoesteri

L’aldeide aromatica e l’etilacetoacetato in quantità equimolari sono mescolati in un pallone a fondo tondo. La piperidina (0,03 mol) e l’acido acetico glaciale (0,04 mol) sono aggiunti alla miscela di reazione. Quest’ultima viene agitata a temperatura ambiente per 90 minuti. Dopo che 20 mL di etere e/o 150 mL di acqua distillata vengono aggiunti alla miscela di reazione, si formano i cristalli con colori diversi. Questi cristalli vengono filtrati e lavati. Poi, vengono essiccati a temperatura ambiente e ricristallizzati in solventi appropriati, principalmente alcoli (etanolo, propanolo e 2-propanolo) e acqua.

4.1.3. Procedura per la preparazione di 3-(4-Idrossi)-Fenilmetilene-2,4-Pentandione (6)

4-Idrossibenzaldeide (3,66 g, 0,03 mol) e acetilacetone (5,14 mL, 0,05 mol) sono mescolati in un pallone a fondo rotondo. La piperidina (0.03 mol) e l’acido acetico glaciale (0.04 mol) sono aggiunti alla miscela di reazione. Quest’ultima viene agitata a temperatura ambiente per 120 minuti. Dopo 150 mL di acqua distillata vengono aggiunti alla miscela di reazione. Si formano cristalli con colori diversi. Questi cristalli vengono filtrati e lavati. Poi vengono essiccati a temperatura ambiente e ricristallizzati in cloruro di metilene.

4.1.4. Procedura generale per la preparazione di prodotti di condensazione con 4-idrossicumarina

L’eradicatore, ottenuto nella reazione precedente, e la 4-idrossicumarina sono mescolati in quantità equimolari in 25-30 mL di metanolo (usato come solvente). Ai reagenti viene aggiunto anche il metossido di sodio (0,003 mol) come agente basico. La miscela di reazione viene bollita e mescolata per 60 ore sotto riflusso. La reazione è controllata da TLC (esano : acetone = 2 : 1 o esano : acetone : cloroformio : metanolo = 5 : 3 : 2 : 1). Quando le quantità di reagenti sono esaurite, il riscaldamento è stato fermato. Il residuo della miscela di reazione è stato filtrato ed è stato lavato con acqua calda, al fine di rimuovere la 4-idroxicumarina che non ha reagito. Dopo di che, il residuo viene essiccato a temperatura ambiente e ricristallizzato in un solvente appropriato (metanolo, etanolo o 2-propanolo).

4.1.5. L’addizione di Michael tra 3-(4-idrossibenzilidene)-2,4-pentanedione (SS-23) e 4-idrossicumari

3-(4-idrossibenzilidene)-2,4-pentanedione (1,02 g, 0,005 mol) e 4-idrossicumarina (0,81 g, 0,005 mol) sono mescolati in leggero eccesso di 4-idrossicumarina in 15-25 mL di metanolo. Ai reagenti viene aggiunta anche la piperidina (0,003 mol) come agente basico. La miscela di reazione viene bollita e mescolata per 60 ore sotto riflusso. La reazione è controllata da TLC (esano : cloroformio : acido acetico = 10 : 10 : 4, esano : cloroformio : acido acetico = 10 : 10 : 2, esano : acetone = 2 : 1). Quando le quantità di reagenti sono esaurite, il riscaldamento è stato fermato. Il residuo della miscela di reazione è stato filtrato e lavato con acqua calda, per rimuovere la 4-idroxicumarina che non ha reagito. Dopo di che, il residuo è stato asciugato a temperatura ambiente e ricristallizzato in acetone.

4.2. Docking molecolare

Tutti i calcoli di docking molecolare sono stati eseguiti con i programmi Maestro Macromodel Glide del pacchetto Schrodinger. Tutte le strutture (sperimentalmente testate e nuove) sono minimizzate dal programma Macromodel, usando il campo di forza OPLS2005 e 5000 iterazioni. La struttura a raggi X dell’enzima HIV-1 proteasi, insieme all’inibitore BEA369, è ottenuta da Protein Data Bank con il codice PDB 1EBY.

4.3. Le linee cellulari e i virus

MT-4-a linea cellulare umana linfoblastoide in sospensione, gentilmente fornita da Gianfranco Pancino- Institute Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Parigi, Francia) rappresentano un modello classico per l’infezione produttiva sperimentale con il ceppo HIV-1 III B e usato come bersaglio di routine per lo studio dell’effetto degli inibitori putativi dell’HIV nella cultura cellulare.

Come fonte di HIV-1, sono stati utilizzati i surnatanti della linea H9/HTLV III B – dono del Dr. R. Gallo (NIH, USA). I supernatanti sono stati raccolti e centrifugati per rimuovere le cellule, e sono stati preparati stock di virus con contenuto noto di antigene p24 (460 pg/mL, Murex HIV Antigen mAB test), attività RT (565.3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Svezia), e infettività (2 × 106 virioni infettivi/mL, microtiter infection assay). Le cellule B MT-4 e H9/HTLV III sono state coltivate in RPMI 1640 integrato con 10% FCS (invitrogen).

4.4. Test di citotossicità e saggi antivirali in coltura cellulare

I composti in studio sono stati prima sciolti in DMSO e ulteriormente diluiti in terreno di crescita cellulare senza siero fetale. Tutte le soluzioni sono state preparate ex tempore.

Sono stati studiati i seguenti parametri: concentrazione citotossica 50-CC50, dove possibile (la concentrazione che impedisce la morte del 50% delle cellule MT-2), concentrazione massima non tossica-MNC, e concentrazione inibitoria 50-IC50 (concentrazione che inibisce del 50% la replicazione virale). CC50 e MNC sono stati rilevati tramite il test di assorbimento MTT. L’IC50 è stata studiata su cellule MT-4 mediante saggio di infezione in microtiter esplorando la protezione delle cellule dall’effetto citopatico dell’HIV misurato mediante il test MTT. Gli esperimenti in condizioni di infezione acuta sono stati eseguiti in micropiastre da 96 pozzetti con 6-8 paralleli/esperimento. I controlli delle cellule (cellule MT-4 con solo mezzo) e i controlli virali (cellule MT-4 infettate dal virus) sono stati eseguiti con ogni esperimento. Per i saggi antivirus, l’HIV è stato aggiunto ad ogni pozzetto per ottenere una molteplicità di infezione pari a 0.1 tranne i controlli delle cellule. L’attacco del virus è stato permesso per un’ora a 37°C/5% CO2. Le piastre sono state incubate per 72-96 ore a 37°C/5% CO2. Dopo di che, il test MTT è stato eseguito come descritto e l’assorbanza delle cellule vitali è stata misurata colorimetricamente a A540 nm. Per tutti gli esperimenti, è stato calcolato il valore medio di ogni colonna (solo se i valori in A540 non differivano di ±10%). Per i saggi antivirali, i valori medi delle file sperimentali e di controllo sono stati confrontati e la percentuale di cellule protette (sopravvivenza cellulare) sotto la concentrazione appropriata della sostanza è stata tracciata contro la concentrazione della sostanza per ottenere l’IC50. La sopravvivenza cellulare (% di protezione cellulare) è stata calcolata secondo la seguente formula: =%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) dove 𝑋 il valore medio di A540 delle cellule infettate da HIV trattate con la concentrazione appropriata del composto in studio; HIV di controllo è il valore medio di A540 delle cellule infettate da HIV senza alcun composto aggiunto; controllo cellulare è il valore medio di A540 delle cellule non infettate e non trattate con inibitore.

Come sostanza di riferimento, sono stati usati ABC (Abacavir, noto inibitore nucleosidico della trascrittasi inversa-NRTI) e pepstatina.

4.4.1. Attività RT endogena ed effetto diretto dei composti sulla RT

E’ stata testata con il test HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Svezia). Il kit contiene RT ricombinante (rRT) come standard, che rende possibile la quantificazione di RT. Per il test RT endogeno, i supernatanti delle cellule MT-4 infettate/non infettate da HIV-1 dopo l’incubazione con/senza composti sono stati testati secondo le linee guida del produttore. Il livello di attività RT nel surnatante è stato calcolato (in pg/mL) dallo standard HIV-1 rRT impostato in ogni kit. L’effetto diretto dei composti sull’attività della rRT è stato misurato con lo stesso kit e mirava a provare la RT come bersaglio dell’azione antivirale. Appropriate diluizioni dell’inibitore sono state preparate nel tampone di controllo e aggiunte alla miscela di reazione. La reazione è stata eseguita per 3 ore a 33°C. L’attività RT delle diluizioni standard è stata confrontata con quella in cui sono stati aggiunti i composti o i controlli (in cui è stata aggiunta solo la miscela di incubazione senza composti).

4.4.2. Un metodo descritto in precedenza da Broglia et al., 2006, per il rilevamento dell’attività della proteasi ricombinante è stato modificato per utilizzare la proteasi virale nativa. Come fonte di proteasi HIV-1 nativa, è stata utilizzata una nuova sospensione di stock virale concentrato (50x) da surnatanti di cellule H9/HTLV IIIB infettate cronicamente. La lisi delle particelle virali e il rilascio dell’enzima attivo (proteasi) è stata eseguita utilizzando un tampone di disgregazione (lisi) contenente il 2,5% di Triton X-100 in tampone fosfato. La concentrazione del liquido di coltura dei tessuti contenente il virus è stata effettuata mediante ultracentrifugazione in Biofuge Stratos, Heraeus, per 1 ora, a 4°C e 35000 giri/min. Il pellet è stato risospeso per ottenere un concentrato 50x in tampone di disgregazione.

La seguente miscela di reazione è stata preparata per ogni esperimento: 1000 𝜇L di tampone fosfato (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L substrato proteasi HIV III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Svizzera) in DMSO, preparato ex tempore; 20 μL di enzima (stock HIV) preso da una soluzione contenente 25 𝜇L di tampone di disgregazione (lisi) + 100 μL di stock HIV, incubato 40 min a 37°C prima dell’esperimento.

L’attività di HIV-1 PR è stata misurata utilizzando la lettura spettrofotometrica diretta dell’utilizzo del substrato di reazione enzimatica a 300 nm, a temperatura ambiente e 1 cm di lunghezza del percorso, utilizzando T80 + spettrofotometro UV-Vis (PG instruments). La velocità di reazione iniziale (V0) è stata regolata per essere 0.0020-0.0030 ΔAbs/min variando l’attività enzimatica (concentrazione virale). Il composto testato e l’inibitore di riferimento (pepstatin utilizzato qui) è stato aggiunto alla miscela di reazione prima di enzima, al fine di eseguire lo screening per l’effetto inibitorio. IC50 è stato definito come la concentrazione del composto testato che diminuisce la velocità della reazione del 50% della velocità iniziale senza composto testato (di riferimento).