Struttura dell’acido lisosomiale umano α-glucosidasi-una guida per il trattamento della malattia di Pompe

Panoramica strutturale

GAA è sintetizzato come una glicoproteina di 110 kDa, che viene indirizzata al lisosoma attraverso il recettore del mannosio-6-fosfato e subisce nel compartimento tardo endosomiale/lisosomiale una serie di eventi proteolitici e di elaborazione di N-glicani per produrre una forma attiva matura composta da quattro peptidi strettamente associati19,20. Poiché la cristallizzazione della forma precursore commerciale Myozyme® di rhGAA (Q57-C952) non ha permesso di ottenere cristalli che diffrangono oltre ~ 7 Å e i predittori di disordine proteico21 hanno indicato la presenza di regioni peptidiche disordinate, abbiamo eseguito la proteolisi in situ con α-cimotripsina per rimuovere i loop di superficie flessibili putativi che ostacolano la formazione di contatti produttivi del cristallo. Il trattamento proteolitico ha prodotto un polipeptide di ~ 5 kDa di massa inferiore rispetto al precursore rhGAA (Fig. 2a), che ha cristallizzato facilmente. Questo ci ha permesso di raccogliere i dati di diffrazione che si estende a 1,9 Å e risolvere la struttura di rhGAA per sostituzione molecolare (Tabella 1). La forma digerita proteoliticamente aveva un’attività paragonabile a quella del precursore (2,34 ± 0,06 e 2,26 ± 0,16 U mg-1 per il precursore e le forme mature, rispettivamente), indicando che il trattamento con α-cimotripsina non ha alterato la funzionalità di rhGAA.

La struttura cristallina di rhGAA corrisponde alla forma matura di GAA placentare umana e rhGAA20 (Fig. 2b), suggerendo che il trattamento con α-cimotripsina ha permesso la rimozione delle regioni proteasi-labili (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 e A782-R794) in un modo paragonabile alla maturazione proteolitica che avviene in vivo. L’architettura generale di rhGAA è simile a quella degli omologhi umani della famiglia delle glicosidi idrolasi GH311, gli enzimi intestinali maltasi-glucoamilasi (MGAM)22,23 e sucrasi-isomaltasi (SI)24 (Fig. 2c e Fig. 1 supplementare). Un dominio N-terminale trefoil Type-P è seguito da un dominio β-sheet, il barile catalitico (β/α)8 che porta due inserti dopo i β-strands β3 (inserto I) e β4 (inserto II), e domini β-sheet prossimali e distali al C-terminus. La forma precursore di rhGAA contiene ~14 kDa di carboidrati e sette siti di glicosilazione sono stati predetti e caratterizzati20. Abbiamo osservato strutture glicano di varie lunghezze per cinque di loro nella struttura di cristallo, in particolare a N140, N233, N390, N470 e N652 (Fig. 2c e Fig. supplementare 2). Abbiamo rilevato una densità elettronica residua di differenza a N882, insufficiente per modellare una struttura del glicano, e non abbiamo osservato una densità elettronica di differenza vicino a N925.

Sito attivo e legame all’inibitore

La stretta tasca di legame al substrato di rhGAA è situata vicino alle estremità C-terminali dei filamenti β del dominio catalitico (β/α)8 e modellata da un loop del dominio N-terminale del foglio β e da entrambi gli inserti I e II (Fig. 2c). Gli enzimi della famiglia GH31 eseguono la catalisi attraverso un classico meccanismo di reazione a doppio spostamento di Koshland con mantenimento della configurazione anomerica del carbonio nel prodotto. Dalla caratterizzazione iniziale del sito catalitico di GAA25 e dall’omologia con i membri meccanicamente sezionati della famiglia GH3126,27, il nucleofilo catalitico e l’acido/base possono essere assegnati a D518 e D616, rispettivamente. Per comprendere l’interazione di rhGAA con il documentato chaperone farmacologico 1-deoxynojirimycin16,28 e il suo derivato N-hydroxyethyl-deoxynojirimycin29 (DNJ e NHE-DNJ, rispettivamente), abbiamo impregnato i cristalli di rhGAA con questi inibitori iminosugar diretti al sito attivo e abbiamo ottenuto per entrambi i complessi dati di diffrazione che si estendono alla risoluzione di 2.0 Å (Tabella 1). DNJ si lega in una conformazione 4C1 nel sottosito legante il substrato -130 ed è stabilizzato da legami idrogeno alle catene laterali di D404, D518, R600, D616 e H674. Ulteriori interazioni stabilizzanti sono fornite da contatti idrofobici con W376, I441, W516, M519, W613 e F649 (Fig. 3a, b). A parte un’inclinazione di 20° nella catena laterale di W376, non si verificano grandi cambiamenti conformazionali su DNJ legame nel sito attivo rhGAA. Questo non è il caso del legame di NHE-DNJ, che adotta la stessa posizione di DNJ, ma dove il sostituente idrossietilico induce sostanziali cambiamenti conformazionali alle catene laterali di M519 e W481 (Fig. 3c, d). In questa conformazione indotta dal ligando, il residuo W481 di rhGAA, situato sulla punta dell’inserto I, stabilisce un’interazione stabilizzante con il sostituente idrossietilico di NHE-DNJ. Simili cambiamenti conformazionali possono essere osservati al legame di NHE-DNJ alla subunità N-terminale di MGAM (NtMGAM)31 (Fig. 3a supplementare).

Riconoscimento del substrato e specificità

Per raccogliere una percezione del riconoscimento del substrato da parte di rhGAA, abbiamo acquisito i dati di diffrazione estesi alla risoluzione di 2,45 Å per un cristallo di rhGAA imbevuto di acarbosio, un analogo del substrato α-1,4-tetrasaccaride non clivabile (Tabella 1). In questo complesso, l’anello valienamine alloggiato nel sottosito -1 adotta una conformazione 2H3 half-chair, ma nonostante questa differenza conformazionale rispetto al DNJ legato nella conformazione 4C1 half-chair, il modello di legame a idrogeno nel sottosito -1 è essenzialmente identico per i due composti (Fig. 3e, f e Fig. 3b supplementare). L’azoto “interglicosidico” non idrolizzabile occupa il centro catalitico ed è legato a idrogeno all’acido/base catalitico D616. La moiety 6-deossiglucosilica nel sottosito + 1 stabilisce attraverso i suoi gruppi 2- e 3-idrossilici legami a idrogeno con il conservato R600 e con D282 originato da un loop nel dominio N-terminale β-sheet. Anche se non conservati in sequenza, i residui di questo loop interagiscono invariabilmente con i ligandi carboidrati in tutte le strutture cristalline disponibili dei membri della famiglia GH31. L’unità di maltosio dell’acarbosio nei sottositi + 2 e + 3 non fa alcuna interazione diretta con rhGAA ed è piuttosto stabilizzata dalle interazioni di impacchettamento del reticolo cristallino e da un contatto mediato dall’acqua con la catena laterale di W618, situata sul bordo della tasca di legame del substrato. Questa scarsità di interazioni suggerisce che rhGAA possiede solo due siti produttivi di legame al substrato, i sottositi -1 e + 1, ma è interessante notare che la parte di maltosio acarbosio legata a rhGAA adotta la stessa posizione generale di quando è legata a NtMGAM22, suggerendo un ruolo funzionale anche per i sottositi + 2 e + 3 in rhGAA (Fig. 3c).

Il glicogeno è un grande polimero costituito da catene lineari di residui di glucosio legati all’α-1,4 che portano rami legati all’α-1,6. Nel citosol la particella di immagazzinamento dell’energia è degradata dall’azione concomitante della glicogeno fosforilasi e di un enzima debranching. All’interno del lisosoma, non è presente alcun enzima di debranching e GAA deve assicurare l’idrolisi di entrambi i legami glicosidici α-1,4- e α-1,6. Tuttavia, rhGAA mostra una chiara preferenza per il primo legame, dato che la costante di specificità sul maltosio è 32 volte superiore rispetto alla costante di specificità sull’isomaltosio (tabella 2 supplementare). Per scoprire la base strutturale per la doppia specificità del substrato, abbiamo tentato di immergere i cristalli di rhGAA con il tetrasaccaride non idrolizzabile glucopyranosyl-α-(1,6)-thio-maltotriose. Tuttavia, questo approccio è fallito, molto probabilmente a causa dei contatti cristallini che impediscono l’alloggio del tetrasaccaride, che in virtù del legame α-1,6 è leggermente più lungo dell’acarbosio. Quest’ultimo è stato osservato per adattarsi a malapena nella fessura di legame del substrato e per aderire strettamente a una molecola legata alla simmetria (Fig. 3e). Abbiamo derivato un disaccaride legato all’α-1,6 all’interno del sito attivo di rhGAA mediante una sovrapposizione strutturale di rhGAA con il dominio catalitico (β/α)8 di Blautia obeum GAA in complesso con isomaltosio32 (rmsd di 1,50 Å per 318 posizioni Cα allineate). Il modello rivela che nessun ostacolo sterico si verifica per la sistemazione di un α-1,6-linkage tra il sottosito -1 e + 1 e che i legami idrogeno produttivi tra la parte glicopiranosica nel sottosito + 1 e D282 sono mantenuti (Fig. 4a, b). Tuttavia, a causa della maggiore lunghezza del legame α-1,6 rispetto al legame α-1,4, il legame a idrogeno stabilizzante con R600 è indebolito, il che potrebbe spiegare la minore attività dell’enzima sui rami con legame α-1,6.

Il dominio secondario di legame al substrato

Nel complesso rhGAA-acarbosio, abbiamo potuto osservare la frazione di acarvosina di una seconda molecola di acarbosio alloggiata in una tasca all’interno del dominio N-terminale trefoil Type-P, situato sulla stessa faccia di rhGAA dove si trova il sito attivo e a 25 Å di distanza dall’acarbosio ivi legato (Fig. 4c). La parte di valienamina si lega a idrogeno con i suoi gruppi 4- e 6-idrossile all’azoto e all’ossigeno della catena principale di C127, all’ossigeno della catena principale di A93 e alla catena laterale di D91. Ulteriori interazioni stabilizzanti sono fornite dalle interazioni di stacking con P125 e W126. P125 e D91 sono conservati o sostituiti da sostituzioni conservative negli enzimi della famiglia GH31 che comprendono un dominio trefoil Type-P (Fig. 4a supplementare). Adiacente al sito secondario di legame dei carboidrati, il loop di superficie G116-M122 è stato tagliato dal trattamento proteolitico. Concepibilmente, la rimozione del segmento G116-M122, unico per i rappresentanti lisosomiali della famiglia GH31 (Fig. 4a, b), potrebbe contribuire alla formazione della tasca secondaria di legame al substrato. Si potrebbe ipotizzare che il sito secondario di legame all’acarbosio su rhGAA rappresenti un vero e proprio sito di legame al substrato che potrebbe migliorare la processività dell’enzima. Questo sito potrebbe anche rappresentare un farmacoforo per lo screening in silico di nuovi chaperon farmacologici. In particolare, un trisaccaride derivato dall’acarbosio è legato al dominio N-terminale della famiglia GH31 α-1,4-glucano liasi da Gracilariopsis lemaneiformis 33 in una posizione vicina al sito secondario di legame al substrato qui descritto (Fig. 5 supplementare).

N-acetilcisteina è un chaperone farmacologico allosterico

Il noto farmaco N-acetilcisteina (NAC) ha dimostrato di agire come chaperone farmacologico allosterico migliorando la stabilità di GAA endogeno mutato e rhGAA utilizzato per ERT, senza influenzare l’attività catalitica18. Per sfruttare il potenziale terapeutico di NAC per la malattia di Pompe attraverso studi strutturali, abbiamo perseguito la struttura cristallina di rhGAA in complesso con NAC. La struttura di risoluzione 1.83 Å del complesso ottenuto da esperimenti di crystal soaking (Tabella 1), rivela due siti di legame NAC remoto dal sito attivo (Fig. 4d, e), fornendo prove strutturali che NAC è davvero un chaperon allosterico, come anticipato da studi funzionali18. Abbiamo accertato tramite saggi di attività e fluorimetria a scansione differenziale che NAC stabilizza altrettanto bene rhGAA e l’enzima maturato proteoliticamente prodotto in questo studio, e che il chaperone è specifico verso GAA, come NAC non ha alcun effetto stabilizzante su un omologo GH31 dal riso (Supplementary Fig. 6a, b e tabelle supplementari 3 e 4). Nella struttura del complesso rhGAA-NAC una molecola di NAC, designata come NAC1, si trova a circa 30 Å dal sito attivo, all’interfaccia tra il barile (β/α)8 e il dominio distale del foglio β (Fig. 4d). NAC1 si lega al carbossile della catena principale di H432 attraverso il suo azoto amidico e la funzione carbossilica stabilisce un contatto mediato dall’acqua con la catena laterale di D513. Il Cβ-Sγ e i gruppi acetilici stabiliscono interazioni di stacking con il gruppo guanidina di R437 e il loop G434-G435, rispettivamente. Una seconda molecola di NAC, parzialmente (75%) occupata (NAC2), si trova all’interfaccia tra il barile (β/α)8 e il dominio prossimale del foglio β ad una distanza di 25 Å dal sito attivo (Fig. 4e). La funzione carbossilica di NAC2 stabilisce un contatto mediato dall’acqua con l’ossigeno della catena principale di L756, il tiolo si impila contro la catena laterale di Q757 e il gruppo acetilico si impila contro la catena laterale di H742. Le due molecole di NAC stabiliscono meno interazioni e più deboli con rhGAA rispetto ai chaperon DNJ e NHE-DNJ. Questo riflette le maggiori concentrazioni di NAC necessarie per l’attività del chaperone (mM vs, µM) come esemplificato dal K D di 11,57±0,74 mM che abbiamo ottenuto con la fluorimetria differenziale a scansione e dal K i di 3,4 e 3,0 µM per DNJ e NHE-DNJ, rispettivamente18,29. Una curva di saturazione sigmoidale che si adatta meglio ai punti sperimentali supporta i siti di legame allosterici di NAC completamente (NAC1) e parzialmente (NAC2) occupati (Fig. 6c supplementare). Le interazioni di stacking stabilite tra i gruppi acetilici di NAC1 e NAC2 e rhGAA devono contribuire significativamente all’energia di legame, poiché gli aminoacidi correlati a NAC, come N-acetilserina e N-acetilglicina hanno ugualmente un effetto stabilizzante su rhGAA, mentre le controparti non acetilate non hanno effetto18. La struttura del complesso rhGAA-NAC mostra una diminuzione dei parametri di spostamento termico atomico dei residui che circondano i siti di legame NAC rispetto a quello di rhGAA non legato, indicando una funzione generale di stabilizzazione interdominio guidato da NAC (Fig. 7a-d supplementare). Nel cristallo NAC sembra anche esercitare un effetto antiossidativo, poiché il residuo C938 è ossidato alla forma di acido sulfenico in tutte le strutture cristalline qui descritte, tranne che nella struttura del complesso rhGAA-NAC (Fig. 8a, b).

NAC e iminosugar mostrano diversi profili di chaperoning

Alcune mutazioni che portano alla malattia di Pompe sono sensibili sia alla NAC che agli iminosugar DNJ e NB-DNJ, mentre altre sono mirate specificamente da uno o l’altro chaperone farmacologico16,17,18. La stragrande maggioranza dei mutanti GAA che rispondono all’attività di chaperone degli iminosugar sono localizzati sia in prossimità del sito attivo che su elementi strutturali che contribuiscono alla sua architettura globale. Nel paziente Pompe, nei fibroblasti e nei modelli murini i mutanti GAA più reattivi alla NAC (A445P, Y455F, e L552P)18 si trovano sugli inserti I e II, dove i corrispondenti residui wild-type contribuiscono alle stabilizzazioni del dominio. A445 insieme a F487 definisce i confini dell’inserto I, e il mutante A445P molto probabilmente destabilizza l’intera impalcatura dell’inserto I (Fig. 9a supplementare). L’idrossile della catena laterale di Y455 sull’inserto I interagisce con un lungo anello del dominio catalitico, mentre la catena laterale di L552 sull’inserto II fa interazioni idrofobiche con residui del dominio N-terminale del foglio β (Fig. 9b, c). I rispettivi mutanti Y455F e L552P hanno sicuramente un effetto destabilizzante generale, che è chiaramente salvato da NAC. Quindi, l’azione chaperone degli iminosugar può essere considerata come un salvataggio conformazionale dei siti attivi strutturalmente perturbati, mentre l’effetto del chaperone allosterico NAC sembra essere dovuto alla stabilizzazione delle fluttuazioni conformazionali complessive o locali.