Studi di stabilità del tiocolchicoside nel bulk e nelle capsule usando RP-HPTLC/Densitometria

Alcuni metodi analitici, come LC-ESI-MS RP-HPLC e UV-Spettrofotometrico sono stati stabiliti per la determinazione del solo tiocolchicoside in formulazioni bulk e farmaceutiche.

Thiocolchicoside è disponibile in combinazione con molti altri farmaci; pertanto, diversi metodi come UV-Spectrophotometric, RP-HPLC e HPTLC sono stati studiati per la determinazione di thiocolchicoside in forme di dosaggio combinate.

Le linee guida della International Conference on Harmonization (ICH) intitolate “Stability Testing of New Drug Substances and Products” richiedono che possano essere effettuati stress test per chiarire le caratteristiche di stabilità intrinseche del principio attivo. Un metodo ideale per la determinazione della stabilità è quello che risolve il farmaco standard così come i suoi prodotti di degradazione. Quindi, un metodo di determinazione affidabile e rapido deve essere sviluppato, che potrebbe anche essere usato per ottenere la separazione ottimale dei componenti di degradazione dal composto genitore. Tuttavia, a nostra conoscenza, nessun articolo relativo alla determinazione RP-HPTLC che indica la stabilità del tiocolchicoside è mai stato menzionato in letteratura. L’obiettivo del lavoro descritto in questo articolo è di stabilire le condizioni per l’identificazione e l’analisi quantitativa del tiocolchicoside in presenza dei suoi prodotti di degradazione per la valutazione della purezza della droga sfusa e la stabilità delle sue forme di dosaggio. L’idoneità del metodo RP-HPTLC che indica la stabilità per la determinazione quantitativa del tiocolchicoside è stata dimostrata dalla convalida in conformità con il requisito delle linee guida ICH.

2. Sperimentale

2.1. Prodotti chimici e reagenti

Tiocolchicoside è stato ottenuto come campione regalo da Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, India. Metanolo di grado HPLC, HCl, NaOH e H2O2 sono stati acquistati da Merck Chemicals, India.

2.2. Strumentazione HPTLC

Lo standard del farmaco e i campioni sono stati macchiati sotto forma di bande di 6 mm di larghezza con una siringa da microlitri CAMAG Linomat (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Svizzera) utilizzando un applicatore CAMAG Linomat a 5 campioni (CAMAG Muttenz, Svizzera) con un tasso di applicazione costante, 150 nL al secondo. Le piastre sono state prelavate con metanolo e attivate a 100°C per 10 minuti prima della cromatografia. La cromatografia è stata eseguita su piastre di alluminio prerivestite con gel di silice 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Germania). Lo sviluppo lineare ascendente con metanolo: acqua (70 : 30 v/v) come fase mobile è stato eseguito in una camera di vetro a doppio canale di 20 × 10 cm (CAMAG Muttenz, Svizzera). Il tempo di saturazione della camera ottimizzato per la fase mobile è stato di 30 minuti a temperatura ambiente (28 ± 2°C). La lunghezza della corsa del cromatogramma era di circa 80 mm. Il tempo di sviluppo della piastra era di 25 min. Dopo lo sviluppo, le piastre sono state asciugate in corrente d’aria da un essiccatore ad aria. Il rilevamento degli spot è stato quindi eseguito a 377 nm con un CAMAG TLC Scanner 3 in modalità di assorbanza gestito dal software winCATS versione 1.3.0. La fonte di radiazione era una lampada al deuterio. Le dimensioni della fessura erano di 6 mm × 0,45 mm e la velocità di scansione di 20 mm al secondo.

2.3. Preparazione di Stock Standard

Soluzione standard di 1 mg/mL di tiocolchicoside in metanolo.

2.4. Studio di linearità

La soluzione standard di riserva nell’intervallo da 0,2 a 1,2 mL è stata trasferita in sei matracci tarati separati da 10 mL e il volume è stato completato con metanolo. Da ciascuna delle soluzioni di cui sopra, 5 μL sono stati applicati su piastre RP-HPTLC per ottenere la concentrazione nell’intervallo da 100 a 600 ng per banda. Il grafico di calibrazione per il metodo è stato costruito come area di picco contro la concentrazione di droga.

2.5. Preparazione della soluzione campione

Per determinare il contenuto di tiocolchicoside in capsula, venti capsule (MYORIL, etichetta claim: 8 mg di tiocolchicoside per capsula) sono state pesate; il contenuto delle capsule è stato rimosso; ed è stato determinato il peso medio. Una quantità equivalente a 8 mg di tiocolchicoside è stata trasferita in un matraccio tarato da 100 mL contenente 50 mL di metanolo e sottoposta a sonicazione per 10 minuti; il volume è stato regolato in base al segno e filtrato con carta da filtro Whatmann n. 41. Un volume di 5 mL è stato diluito a 10 mL con metanolo; soluzione risultante 5 μL applicato sulla piastra RP-HPTLC per il dosaggio di tiocolchicoside. Le piastre sono state sviluppate e scansionate come descritto sopra.

2.6. Convalida del metodo

Il metodo è stato convalidato per i seguenti parametri secondo le linee guida ICH.

2.6.1. Precisione

La ripetibilità dell’applicazione del campione e la misurazione dell’area di picco sono state eseguite utilizzando sei repliche della concentrazione di prova (400 ng per banda di tiocolchicoside). La variazione intra- e intergiornaliera per la stima del tiocolchicoside è stata eseguita utilizzando tre repliche a tre diversi livelli di concentrazione (200, 300 e 500 ng per banda).

2.6.2. Limite di rilevamento (LOD) e limite di quantificazione (LOQ)

Per determinare il limite di rilevamento e quantificazione, sono state utilizzate concentrazioni di tiocolchicoside nella parte inferiore dell’intervallo lineare della curva di calibrazione. Dalla soluzione standard stock, tiocolchicoside 100, 120, 140, 160, 180 e 200 ng per banda è stato applicato in triplicato su piastra RP-HPTLC e LOD e LOQ sono stati calcolati utilizzando le seguenti equazioni: dove “” è la deviazione standard delle aree dei picchi dei farmaci (), presa come misura del rumore e “” è la pendenza della curva di calibrazione corrispondente.

2.6.3. Specificità

La specificità del metodo è stata controllata analizzando il farmaco standard e il campione. La banda per il tiocolchicoside nel campione è stata confermata confrontando i valori e gli spettri della banda con quelli del farmaco standard. La purezza del picco del tiocolchicoside è stata confermata confrontando gli spettri a tre livelli diversi, cioè le posizioni peak-start (), peak-apex (), e peak-end () della banda.

2.6.4. Robustezza

La robustezza del metodo è stata eseguita analizzando 400 ng di tiocolchicoside da due diversi analisti mantenendo le stesse condizioni sperimentali e ambientali.

2.6.5. Accuratezza

Nove bande di soluzione campione di tiocolchicoside (200 ng per banda) sono state applicate su piastra, e poi la quantità nota di tiocolchicoside è stata applicata in triplicato all’80, 100, e 120% (160, 200 e 240 ng per banda) della concentrazione del campione (200 ng per banda) e rianalizzata dal metodo proposto. Questo è stato eseguito per valutare lo studio di recupero del farmaco a diversi livelli nelle formulazioni.

2.6.6. Robustezza

Apportando piccole modifiche alla composizione della fase mobile, alla quantità di fase mobile, al tempo dall’applicazione allo sviluppo e al tempo dallo sviluppo alla scansione sono stati esaminati gli effetti sui risultati. Sono state provate fasi mobili con diverse composizioni di metanolo: acqua (72 : 28 v/v) e metanolo: acqua (68 : 32 v/v) e sono stati eseguiti cromatogrammi. Le piastre sono state prelavate con metanolo e attivate a 80 ± 5°C per 2, 5 e 8 minuti prima della cromatografia. La robustezza del metodo è stata eseguita utilizzando sei repliche dello stesso spot (400 ng per banda di tiocolchicoside).

2.7. Degradazione forzata del tiocolchicoside

2.7.1. Idrolisi con acido e base

Una quantità pesata accuratamente di 10 mg di tiocolchicoside è stata sciolta separatamente in 10 mL di soluzione metanolica di 1,0 M HCl e 0,5 M NaOH, rispettivamente e riflussata per 30 minuti a 60°C al buio per evitare il probabile effetto degradativo della luce. Un volume di 1,0 mL dalle soluzioni di cui sopra è stato preso separatamente, neutralizzato e diluito fino a 10 mL con metanolo. Le soluzioni risultanti sono state applicate sulle piastre RP-HPTLC in triplicato (5 μL ciascuno, cioè 500 ng per banda). I cromatogrammi sono stati sviluppati e scansionati come descritto sopra.

2.7.2. Degradazione ossidativa

Per la degradazione ossidativa, una quantità accuratamente pesata di 10 mg di tioclochicoside è stata sciolta separatamente in 10 mL di soluzione metanolica di 1% v/v H2O2 e 3% v/v H2O2, rispettivamente e tenuta al buio a temperatura ambiente per 30 min. Dopo 30 minuti, 1,0 mL da ciascuna delle soluzioni di cui sopra sono stati presi e diluiti fino a 10 mL con metanolo. Le soluzioni risultanti sono state applicate su piastre RP-HPTLC in triplicato (5 μL ciascuno, cioè 500 ng per banda). I cromatogrammi sono stati sviluppati e scansionati come descritto sopra.

2.7.3. Degradazione al calore secco

Una quantità pesata accuratamente di 10 mg di tiocolchicoside è stata conservata a 70°C per 8 ore in un forno. È stato trasferito in un matraccio volumetrico da 10 mL contenente metanolo e il volume è stato portato a segno. 1,0 mL della soluzione di cui sopra è stato preso e diluito fino a 10 mL con metanolo. La soluzione risultante è stata applicata sulla piastra RP-HPTLC in triplicato (5 μL ciascuno, cioè 500 ng per banda). Il cromatogramma è stato sviluppato e scansionato come descritto sopra.

2.7.4. Degradazione fotografica

Una quantità pesata accuratamente di 10 mg di tiocolchicoside è stata sciolta in 10 mL di metanolo e le soluzioni sono state tenute per un periodo di 24 ore alla luce. Un volume appropriato 1.0 mL di soluzione sopra è stato preso e diluito fino a 10 mL con metanolo. La soluzione risultante è stata applicata sulla piastra RP-HPTLC in triplicato (5 μL ciascuno, cioè 500 ng per banda). Il cromatogramma è stato sviluppato e scansionato come descritto sopra.

3. Risultati e discussione

3.1. Sviluppo della fase mobile ottimale

Per la selezione della fase mobile appropriata per la separazione di tiocolchicoside, diverse corse sono state esercitate utilizzando fasi mobili contenenti solventi di varia polarità, a diversi livelli di concentrazione. Tra le diverse combinazioni di fase mobile impiegate, la fase mobile costituita da metanolo: acqua (70 : 30 v/v) ha dato un picco netto e ben definito al valore di 0,60 ± 0,02 (Figura 2). Le bande ben distinte sono state trovate quando la camera è stata saturata con la fase mobile per 30 minuti a temperatura ambiente.

Figura 2

Cromatogramma del tiocolchicoside standard con ( 0,60 ± 0,02) a 377 nm in metanolo: acqua (70 : 30 v/v) come fase mobile.

3.2. Curva di calibrazione

I dati di regressione lineare per le curve di calibrazione () hanno mostrato una buona relazione lineare nell’intervallo di concentrazione di 100-600 ng per banda. L’equazione di regressione lineare è risultata essere , = 0,9984 (Figura 3).

Figura 3

Curva di calibrazione del tiocolchicoside (100-600 ng per banda).

3.3. Convalida del metodo

Il metodo sviluppato è stato convalidato secondo le linee guida ICH.

La precisione del metodo è stata rivelata in termini di % di deviazione standard relativa (% RSD) dell’area del picco. I risultati (Tabella 1) hanno epitomizzato la precisione sonora del metodo che sono stati determinati dalla pendenza della parte più bassa del grafico di calibrazione. Il LOD e il LOQ sono stati trovati per essere 9,77 ng e 29,63 ng, rispettivamente, che indica la sensibilità del metodo, è adeguato.

Gli studi di recupero sono stati eseguiti all’80%, 100% e 120% della concentrazione di prova secondo le linee guida ICH. Il recupero % di thiocolchicoside a tutti e tre i livelli è stato trovato nell’intervallo di 99,92-100,04%. Le quantità di farmaco aggiunto e determinato e il recupero % sono mostrati in (Tabella 2). Il picco-purezza di thiocolchicoside è stato confermato valutando gli studi di spettri a picco-inizio, picco-apex e picco-fine posizioni della banda, che è, (, ) = 0.9995 e (, ) = 0.9986 mostrando specificità del metodo (Figura 4). Una buona correlazione ( = 0,9989) è stata ottenuta tra il farmaco standard e il farmaco estratto dalla formulazione della capsula. La robustezza del metodo è stata sperimentata facendo un’alterazione intenzionale nelle condizioni cromatografiche, ed è stato osservato l’effetto sul cromatogramma. La deviazione standard delle aree dei picchi è stata calcolata per ogni parametro e la % RSD è risultata inferiore al 2%. I bassi valori di % RSD indicano la robustezza del metodo; i risultati sono mostrati in (Tabella 3). La robustezza del metodo è stata verificata da diversi analisti e la % RSD è risultata essere 0,57 e 0,58, il che indica che il metodo è robusto.

Figura 4

Spettri di purezza di picco del tiocolchicoside standard (a) e del tiocolchicoside estratto dalla capsula (b) analizzati nelle posizioni peak-start, peak-apex e peak-end.

3.4. Analisi della formulazione commercializzata

Tiocolchicoside quando estratto dalla formulazione della capsula ha dimostrato una singola macchia avente = 0,60 ± 0,02 nel cromatogramma. Il contenuto medio di droga di % è stato trovato per essere 100,27% della richiesta dell’etichetta con 0,88% RSD.

3.5. Proprietà indicante la stabilità

3.5.1. Degradazione acida

La degradazione forzata del tiocolchicoside in 1,0 M HCl (60°C per 30 min) è risultata instabile e ha mostrato due picchi aggiuntivi ai valori 0,33 e 0,71 (Figura 5(a)). Le macchie dei prodotti degradati erano ben separate dalla macchia di tiocolchicoside.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 5

RP-Cromatogrammi HPTLC ottenuti dal tiocolchicoside degradato da (a) idrolisi acida (1 M HCl), (b) idrolisi alcalina (0.5 M NaOH), (c) stress ossidativo (1% v/v H2O2), e (d) stress ossidativo (3% v/v H2O2).

3.5.2. Degradazione di base

Tiocolchicoside è stato trovato instabile durante l’idrolisi alcalina in 0,5 M NaOH a 60°C per 30 min. Il farmaco ha mostrato un picco aggiuntivo al valore 0,72 con tiocolchicoside rimasto a 0,60 (Figura 5(b)). Le macchie dei prodotti degradati erano ben separate dalle macchie della droga.

3.5.3. Degradazione ossidativa

Il tiocolchicoside possiede un atomo di zolfo, che è più suscettibile all’ossidazione da parte di H2O2. Dopo il trattamento del tiocolchicoside con 1% v/v H2O2, sono stati osservati tre picchi aggiuntivi ai valori 0.38, 0.46 e 0.70 insieme al tiocolchicoside rimasto a 0.60 (Figura 5(c)). In degradazione ossidativa con 3% v/v H2O2 tiocolchicoside ha subito una degradazione completa risultante in due picchi principali a valori 0.58 e 0.64 e un picco a 0.70, rispettivamente (Figura 5 (d)). Gli spettri di picco-purezza di tiocolchicoside recuperato dopo la degradazione in 1 M HCl, 0,5 M NaOH, e 1% v/v H2O2 e tiocolchicoside standard scansionato a picco-inizio, picco-apex, e le posizioni di fine picco del punto sono come mostrato in (Figura 6). I risultati degli studi di stress test hanno rivelato che il metodo era altamente specifico per il tiocolchicoside. I prodotti di degradazione erano completamente distinguibili dal composto genitore. Nessuna decomposizione è stata identificata sull’esposizione della soluzione di droga alla luce del sole durante la degradazione fotografica e termica che indica la stabilità della droga ad entrambe le condizioni. I risultati dello studio di degradazione forzata del tiocolchicoside sono riassunti in (Tabella 4).