Principi di assemblaggio appresi da studi in vitro
Subunità ribosomiali batteriche 30S e 50S funzionali possono essere ricostituite in vitro da rRNA più ciascuna delle proteine ribosomiali. Studi dettagliati dei principi biochimici e biofisici alla base dell’assemblaggio dei ribosomi in vitro hanno fornito utili paradigmi per guidare le indagini sulla biogenesi dei ribosomi in vivo.
Uno dei primi principi rivelati da questi esperimenti è che l’assemblaggio delle proteine r nelle subunità ribosomiali avviene in modo gerarchico. Gli studi di ricostituzione delle subunità ribosomiali 30S batteriche hanno definito una “mappa di assemblaggio” per l’ordine di associazione di ogni r-proteina con l’rRNA. In base al loro ordine nella gerarchia di legame, le proteine r sono designate come primarie (legandosi direttamente all’rRNA), secondarie (il legame dipende dalle proteine di legame primarie) o terziarie (il legame dipende dalle proteine di legame secondarie). Mentre una tale mappa di dipendenza ha dimostrato di essere un punto di partenza molto utile, non fornisce alcuna informazione sulla cinetica del legame delle proteine. Piuttosto, il percorso di assemblaggio può in gran parte riflettere l’ordine in cui ogni r-proteina è più stabilmente associata all’rRNA. Inoltre, la mappa di assemblaggio non prende in considerazione il percorso di ripiegamento dell’rRNA 16S indipendente dalle proteine r o il ruolo nell’assemblaggio del ribosoma dell’elaborazione nucleolitica dei precursori dell’rRNA che avviene in vivo. Più recentemente, questi aspetti dell’assemblaggio della subunità 30S sono stati esplorati più in dettaglio usando tecniche come il sondaggio chimico e dei radicali idrossilici della conformazione dell’RNA per valutare i cambiamenti nella conformazione dell’rRNP con il tempo, e la spettrometria di massa (PC/MS) per determinare la cinetica del legame della r-proteina all’rRNA.
Una possibile spiegazione per l’osservazione di r-proteine di legame primario nella mappa di assemblaggio è che i loro siti di legame sono creati almeno in parte dalla conformazione adottata da 16S rRNA indipendente dalle r-proteine. Infatti, coerentemente con questa idea e con la visione che i ribosomi si sono evoluti da un catalizzatore di RNA, è stato dimostrato che il dominio 5′ di 16S rRNA può ripiegarsi e formare contatti terziari in assenza di tutte le r-proteine. Questa struttura terziaria non è presumibilmente completamente stabile in assenza di contatti proteici e, quindi, è molto probabilmente stabilizzata dal legame delle r-proteine a siti che sono creati da conformazioni transitorie adottate dall’rRNA durante il suo ripiegamento. Pertanto, il secondo principio suggerisce che il ripiegamento dell’rRNA fornisce la base del legame delle r-proteine durante l’assemblaggio del ribosoma.
Un terzo principio che è emerso dagli studi in vitro dei ribosomi batterici è che il rafforzamento del legame delle r-proteine con l’rRNA avviene man mano che l’assemblaggio del ribosoma procede. Molte r-proteine contattano più nucleotidi sull’rRNA. Il footprinting dei radicali ossidrilici risolto nel tempo ha rivelato che alcuni di questi nucleotidi sono protetti prima di altri, suggerendo che con l’avanzare della biogenesi dei ribosomi, le proteine r stabiliscono più contatti con l’rRNA, diventando così più stabilmente integrate con i ribosomi.
Lo stabilimento iniziale di alcuni contatti tra le proteine r e l’rRNA potenzialmente stabilizza alcune conformazioni di RNA e induce cambiamenti nella conformazione dell’rRNA per fornire siti di legame per ulteriori proteine r (secondarie o terziarie). Quindi, il legame tra le proteine r consolida i guadagni di ripiegamento dell’RNA e conferisce direzionalità al processo di assemblaggio. Questo suggerisce un modello in cui l’assemblaggio procede attraverso una serie alternata di cambiamenti conformazionali dell’RNA e il legame delle proteine, che stabilizzano sequenzialmente la struttura finale dell’RNA. I dati cinetici hanno rivelato che l’assemblaggio delle subunità mature 30S avviene attraverso percorsi di ripiegamento dell’RNA multipli e paralleli, che convergono tutti sul prodotto finale. Questo ha portato al concetto di un paesaggio di assemblaggio in contrapposizione a un unico percorso in cui avviene l’assemblaggio delle subunità ribosomiali.
Infine, studi in vitro hanno rivelato che l’assemblaggio dei ribosomi avviene nella direzione 5′ – 3′. La PC/MS e il sondaggio chimico della struttura secondaria dell’rRNA hanno dimostrato che il legame della proteina r al dominio 5′ dell’rRNA può essere osservato prima che i contatti della proteina siano stabiliti con il dominio 3′ dell’rRNA. Al contrario, i saggi di footprinting dei radicali idrossilici hanno mostrato un’esplosione iniziale di protezione del nucleotide lungo tutto il 16S rRNA, indicando che il ripiegamento dell’RNA si nuclearizza da molti siti diversi sparsi nell’RNA, e quindi indicando una mancanza di direzionalità da 5′ a 3′ nell’assemblaggio. Queste osservazioni contrastanti possono essere riconciliate prendendo in considerazione la natura dei diversi setup sperimentali. PC / MS misura la cinetica di legame della proteina a rRNA, e come tale solo stabile r-proteine-rRNA interazioni possono essere rilevati perché r-proteine che si legano debolmente durante l’impulso può essere lavato via durante la caccia. Footprinting saggi, d’altra parte, in grado di catturare la protezione nucleotide da entrambi debolmente interagenti e stabile-associati r-proteine. Presi insieme, questi dati indicano che mentre l’assemblaggio del ribosoma può nucleare attraverso l’intero rRNA, la stretta associazione finale delle r-proteine con l’rRNA avviene in una direzione da 5′ a 3′.
È importante considerare come questi esperimenti in vitro potrebbero o non potrebbero riflettere l’assemblaggio in vivo. Per esempio, quando l’assemblaggio del ribosoma si verifica in vivo, è accoppiato con la trascrizione di rRNA, che presumibilmente contribuisce anche alla direzionalità osservata 5′ a 3′ dell’associazione r-proteina. rRNA può essersi evoluto per piegare 5′ a 3′ come è sintetizzato, e per incorporare r-proteine così, accoppiando così l’assemblaggio con la trascrizione di rRNA. Inoltre, il requisito di una fase di riscaldamento durante la ricostituzione delle subunità ribosomiali in vitro e l’identificazione di un certo numero di mutanti batterici che sono difettosi nella produzione di ribosomi indicano la necessità di fattori trans-agenti durante la biogenesi del ribosoma in vivo.