Test di attivazione dei basofili: sfida alimentare in provetta o strumento di ricerca specializzato?

Il gold-standard per la diagnosi di allergia alimentare è la sfida alimentare orale (OFC). Tuttavia, l’OFC richiede l’ingestione del sospetto alimento colpevole e può causare una reazione allergica acuta, che è potenzialmente grave. Per questo motivo, l’OFC deve essere eseguito in un ambiente supervisionato con le strutture e le competenze per trattare le reazioni allergiche e l’anafilassi, se si verificano. L’OFC può causare un’ansia significativa nei pazienti, nei genitori e anche nel personale clinico, poiché comporta un rischio considerevole. Quindi, quando possibile, la diagnosi di allergia alimentare è stabilita da un’anamnesi recente e convincente di una reazione allergica IgE-mediata all’alimento colpevole, combinata con l’evidenza di una sensibilizzazione IgE allo stesso alimento tramite test cutaneo (SPT) e/o IgE specifiche nel siero (sIgE). Gli OFC sono riservati ai casi in cui i risultati di SPT e/o sIgE sono equivoci. Con l’aumento della consapevolezza e della prevalenza dell’allergia e della sensibilizzazione alimentare, sempre più pazienti vengono testati per l’allergia alimentare. L’assenza di un’anamnesi di esposizione orale ad alimenti allergenici, con conseguente reazione allergica o in assenza di sintomi clinici, può rendere l’interpretazione dei risultati della SPT e delle sIgE particolarmente difficile. I neonati e i bambini piccoli che non hanno mai assunto determinati alimenti allergenici costituiscono una percentuale considerevole dei pazienti visti nelle cliniche allergologiche e spesso hanno bisogno di un OFC per chiarire il loro stato allergico. Questo si traduce in una crescente domanda nell’esecuzione di OFC. I servizi di allergologia hanno difficoltà a rispondere a questa domanda e i pazienti possono dover aspettare diversi mesi prima di ricevere una diagnosi esatta di allergia o tolleranza alimentare tramite OFC, il che può portare a restrizioni dietetiche non necessarie e a un’ansia significativa associata all’incertezza diagnostica. L’OFC è anche il gold-standard per valutare la risoluzione dell’allergia alimentare, per determinare la dose soglia e per monitorare la risposta clinica ai trattamenti immunomodulatori per l’allergia alimentare. Negli studi di ricerca, i pazienti allergici devono spesso sottoporsi a ripetuti OFC per valutare se c’è stato un miglioramento clinico.

Il BAT, essendo un test funzionale, ha il potenziale di assomigliare più da vicino al fenotipo clinico dei pazienti rispetto ai test allergologici che rilevano semplicemente la presenza di IgE allergene-specifiche. In termini semplici, il BAT può essere visto come un OFC in provetta, dove invece di dare il cibo a un bambino per bocca, i basofili coinvolti nelle reazioni allergiche acute sono esposti a un estratto alimentare in una provetta. Nonostante l’analogia, le differenze tra le due procedure e le loro applicazioni cliniche possono essere evidenziate e qui si pone la questione se il BAT può imitare fedelmente il gold standard OFC, cioè se il BAT può riprodurre in vitro la reazione allergica che avviene in vivo durante un OFC positivo.

Il test di attivazione dei basofili

Il BAT è un test basato sulla citometria a flusso in cui si misura l’espressione dei marcatori di attivazione sulla superficie dei basofili dopo la stimolazione con l’allergene -Fig. 1. Un test di attivazione dei basofili positivo può essere visto come un surrogato in vitro di una reazione allergica acuta in vivo. In uno studio su pazienti allergici al veleno di imenotteri, è stata osservata un’up-regolazione dei marcatori di attivazione dei basofili sia in vitro dopo la stimolazione con il veleno della giacca gialla o dell’ape, sia ex vivo dopo una sfida positiva alla puntura. Nello stesso studio, c’era un accordo generale tra la presentazione clinica (reazione sistemica contro ampia reazione locale) e i risultati del BAT, suggerendo che il BAT è un potenziale biomarcatore di anafilassi. Anche nei pazienti allergici agli alimenti è stato trovato un buon accordo tra i risultati del BAT e l’esito dell’OFC. Nei pazienti allergici all’alfa-gal con reazioni allergiche ritardate di tipo immediato alla carne rossa, l’attivazione dei basofili ex vivo nel sangue raccolto in diversi punti temporali ha coinciso con lo sviluppo di reazioni allergiche sistemiche in vivo durante l’OFC. I risultati di questo studio rafforzano il ruolo dei basofili nelle reazioni allergiche IgE-mediate indotte dal cibo e nell’anafilassi.

Diversi marcatori della superficie cellulare possono essere utilizzati per identificare i basofili nel sangue intero, compresi IgE, CD123 (con HLA-DR), CCR3 o CRTH2 (con CD3) o CD203c .

Nel sangue periferico, le IgE vengono rilevate su basofili, cellule dendritiche, eosinofili, monociti, macrofagi, cellule B e piastrine, quindi non sono specifiche per i basofili. Il CD123 è la subunità a bassa affinità (α) del recettore dell’IL-3. È espresso in alti livelli sulle cellule dendritiche plasmacitoidi e sui basofili e in bassi livelli su monociti, eosinofili, cellule dendritiche mieloidi e sottoinsiemi di cellule progenitrici ematologiche. Un’ulteriore colorazione con HLA-DR discrimina tra i basofili HLA-DR-negativi e le cellule dendritiche e i monociti HLA-DR-positivi. CCR3 è il recettore per le chemochine di tipo C-C (e.g. eotaxin, MCP e RANTES) ed è altamente espresso su basofili ed eosinofili ma anche su cellule Th1 e Th2. CRTH2 è un altro marcatore che è espresso da basofili, eosinofili e cellule T, e quindi come CCR3, richiede un marcatore di cellule T, come CD3, per distinguere i basofili dalle cellule T. CD203c è costitutivamente e specificamente espresso sui basofili e quindi può essere usato come un singolo marcatore di identificazione o in combinazione con altri marcatori.

In seguito alla stimolazione con l’allergene, l’espressione di diverse proteine è up-regolata sulla superficie dei basofili, in particolare CD63 e CD203c. CD63 è una proteina di membrana associata ai lisosomi (LAMP), che non è espressa sulla superficie dei basofili a riposo ma solo sulla membrana dei granuli all’interno delle cellule. Quando i granuli si fondono con la membrana plasmatica dei basofili durante la degranulazione, CD63 diventa espresso sulla superficie dei basofili. CD203c è un enzima che scinde i legami fosfodiestere e fosfosolfato, rimuovendo idroliticamente i 5′-nucleotidi successivamente dai 3′-idrossi-termini degli oligonucleotidi. È espresso esclusivamente e costitutivamente a bassi livelli sulla superficie dei basofili e dei mastociti e la sua espressione aumenta con l’attivazione cellulare. I marcatori di attivazione dei basofili sembrano formare due gruppi distinti di marcatori che vengono up-regolati contemporaneamente: uno che comprende CD63, CD107a e CD107b e un altro che comprende CD203c, CD13 e CD164 . CD63 e CD203c sono i marcatori di attivazione dei basofili più comunemente usati.

La procedura di laboratorio del BAT consiste in tre fasi: stimolazione delle cellule, colorazione delle cellule e citometria a flusso – figura 1. Il sangue dovrebbe essere trattato il più presto possibile dopo la raccolta del sangue, poiché i basofili perdono la loro vitalità e reattività nel tempo. Tuttavia, gli studi sono stati eseguiti con campioni conservati a +4 °C fino a 24 ore. Un piccolo volume di sangue (circa 1-2 ml a seconda del numero di condizioni) è necessario per il BAT. Estratti grezzi di allergeni o allergeni purificati o ricombinanti possono essere utilizzati per la stimolazione cellulare. Si dovrebbero usare diverse concentrazioni di allergeni, poiché la sensibilità dei basofili alla stimolazione di allergeni specifici varia tra i pazienti.

I risultati del BAT possono essere determinati in termini di percentuale di basofili che esprimono il marker di attivazione definito o in termini di intensità di fluorescenza media (MFI) calcolando l’indice di stimolazione, cioè il rapporto tra l’MFI della condizione selezionata e l’MFI del controllo negativo. Il primo è di solito usato per il CD63 poiché il CD63 non è espresso nelle cellule a riposo e la sua espressione dopo l’attivazione è bimodale. Il secondo è di solito usato per il CD203c che è già espresso nelle cellule a riposo e il suo aumento dopo la stimolazione dell’allergene è unimodale-Fig. 2.

Nei pazienti allergici, l’attivazione dei basofili indotta dall’allergene si traduce tipicamente in una curva dose-risposta a campana, con concentrazioni crescenti dell’allergene (di solito 5-6 log di differenza) che portano a un aumento progressivo dell’espressione dei marcatori di attivazione dei basofili fino a raggiungere un plateau-Fig. 3.

C’è un ampio grado di variabilità nella risposta dei basofili all’allergene tra gli individui. Per esprimere questa eterogeneità e confrontare le risposte dei basofili tra diversi pazienti, si possono determinare vari parametri basati sulla curva dose-risposta, come CD-max e EC50 (50 % di concentrazione efficace) o CDsens. CD-max è l’attivazione massima e corrisponde alla proporzione massima di basofili attivati a qualsiasi concentrazione di allergene. EC50 è la dose efficace al 50% dell’attivazione massima e può anche essere rappresentata come CDsens. Descritto per la prima volta da Johansson, CDsens è l’inverso della concentrazione efficace semimassimale, cioè la concentrazione alla quale l’attivazione dei basofili è la metà dell’attivazione massima, per 100 e può essere calcolato utilizzando la formula CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax e CDsens sono misure della reattività dei basofili e della sensibilità dei basofili, rispettivamente. La reattività dei basofili può essere definita come il grado di attivazione dei basofili, cioè la proporzione di basofili attivati, e può anche essere misurata come la percentuale di basofili CD63-positivi a diverse concentrazioni di allergene o come il rapporto della percentuale di CD63-positivi dopo la stimolazione con allergene e con anti-IgE. La sensibilità dei basofili si riferisce alla concentrazione di allergene alla quale i basofili si attivano e può essere espressa come percentuale della dose massima efficace (ad esempio EC5, EC10) oltre a EC50 e CDsens, precedentemente menzionati. La figura 3 rappresenta la risposta dei basofili di due diversi individui, uno con una maggiore reattività e sensibilità dei basofili (blu) e l’altro con una minore reattività e sensibilità dei basofili (rosso), cioè con una minore proporzione di basofili che si attivano in risposta a concentrazioni più elevate dell’allergene. Shreffler e Patil hanno proposto un nuovo parametro per misurare le risposte dei basofili, l’area sotto la curva dose-risposta, che ha il vantaggio di combinare la reattività e la sensibilità dei basofili.

Usare il test di attivazione dei basofili per diagnosticare le allergie alimentari

In uno studio recentemente pubblicato, abbiamo valutato l’utilità del BAT per diagnosticare l’allergia alle arachidi in una popolazione ben caratterizzata di bambini allergici alle arachidi, sensibilizzati e non sensibilizzati. Il BAT ha mostrato un’elevata accuratezza (97%) nella diagnosi di allergia alle arachidi e ha permesso una riduzione del numero di OFC richiesti del 66%. Abbiamo convalidato i cut-off diagnostici in una popolazione reclutata in modo prospettico e indipendente e la performance diagnostica del BAT era ancora molto buona in questa seconda popolazione di studio. Negli ultimi anni, altri studi hanno valutato le prestazioni del BAT nella diagnosi di allergia a diversi alimenti, tra cui arachidi, latte vaccino, uova, grano, nocciole, crostacei e pesca, così come nella diagnosi di sindromi polliniche-alimentari -Tabella 1. Case report e piccole serie di casi hanno suggerito che il BAT può essere utile anche per diagnosticare l’allergia al sesamo e agli elicitori meno comuni delle reazioni allergiche alimentari IgE-mediate, come il riso e i galatto-oligosaccaridi a catena corta presenti nei prebiotici. Un position paper recentemente pubblicato dalla European Academy of Allergy and Clinical Immunology passa in rassegna le applicazioni cliniche del BAT.

Vari fattori possono influenzare la performance diagnostica e i valori di cut-off del BAT in diversi studi, alcuni legati alla popolazione dello studio, alcuni legati al disegno dello studio, alcuni legati alla procedura di laboratorio e alla metodologia adottata per le analisi dei dati -Tabella 2. Gli studi esistenti sono eterogenei nella maggior parte di questi aspetti, il che limita la loro comparabilità e una più ampia applicazione dei cut-off diagnostici determinati in studi specifici. Il criterio di diagnosi di ogni allergia alimentare è allergene-specifico e l’accuratezza diagnostica potrebbe non essere la stessa per allergeni diversi. Inoltre, i cut-off definiti in una popolazione non sono necessariamente trasferibili direttamente a un’altra popolazione di una diversa posizione geografica valutata in un diverso centro allergologico. Una limitazione del BAT è il fatto che una piccola percentuale di pazienti testati ha basofili non rispondenti (cioè basofili che rispondono a un controllo positivo non IgE-mediato ma non a stimolanti IgE-mediati) e quindi hanno un risultato non interpretabile per il test. Ulteriori sfide nella traduzione del BAT da metodo di ricerca a test diagnostico in clinica sono legate alla standardizzazione del test e alla sua riproducibilità e anche al rapporto costo-efficacia dell’inclusione del BAT nell’approccio diagnostico dei pazienti con sospetta allergia alimentare. Questi aspetti non sono ancora stati stabiliti e richiedono ulteriori ricerche.

La metodologia adottata per eseguire la procedura di laboratorio e per analizzare i dati della citometria a flusso può avere un impatto significativo sui risultati ottenuti per il BAT e, di conseguenza, sulla sua accuratezza diagnostica. Per esempio, identificare i basofili usando un anticorpo anti-IgE può attivare le cellule e alterare i risultati ottenuti con un metodo diverso per identificare i basofili. L’espressione di alcuni marcatori di identificazione dei basofili, come CCR3 e CD123 può cambiare in seguito all’attivazione dei basofili. In uno studio recente, abbiamo descritto che in circa un quarto dei pazienti, l’espressione di CD123, come rilevato dalla citometria a flusso, può essere ridotta in seguito all’attivazione dei basofili e quindi portare a una significativa perdita di cellule attivate utilizzando metodi che si basano su questo marcatore per identificare i basofili. Questo potrebbe comportare un aumento del numero di diagnosi errate, in particolare di falsi negativi, con conseguenze importanti per i singoli pazienti. L’aggiunta del marcatore specifico dei basofili CD203c alla strategia di gating ha mantenuto il numero di cellule e ha permesso di ridurre il numero di falsi negativi (da 5 a 1 %). La strategia di gating modificata ha migliorato sia la sensibilità (da 88 a 98%) che la specificità (da 94 a 96%) del BAT, con un conseguente miglioramento complessivo dell’accuratezza del BAT per diagnosticare l’allergia alle arachidi dal 91 al 97% – Figura 4. Per condurre e interpretare con successo il BAT, “il diavolo è nei dettagli”; pertanto, è molto importante considerare attentamente gli aspetti metodologici del BAT.

In generale, come test diagnostico, il BAT ha mostrato un’elevata specificità e un valore predittivo positivo. Abbiamo convalidato i cut-off diagnostici determinati per l’allergia alle arachidi in una popolazione indipendente reclutata prospetticamente e la specificità e il valore predittivo positivo del BAT hanno raggiunto il 100%. L’alta specificità è un’importante aggiunta ai test allergologici esistenti, come SPT e sIgE, che hanno un’alta sensibilità ma non sono molto specifici. L’alta specificità implica che un BAT positivo conferma la diagnosi di allergia alimentare con sicurezza, ma un BAT negativo non esclude necessariamente la diagnosi. A seconda del rapporto costi-benefici e degli aspetti di sicurezza, l’OFC può essere fatto in pazienti in cui il BAT fornisce un risultato inconcludente (cioè pazienti con basofili non rispondenti) o in pazienti in cui il BAT fornisce un risultato inconcludente e in pazienti in cui il BAT era negativo.

L’approccio per decidere sulla necessità dell’OFC dopo il BAT dipende anche da come viene considerato il risultato del BAT nel contesto dei risultati di altri test allergici, sia in combinazione, quando tutti i risultati disponibili vengono considerati simultaneamente, sia in sequenza, quando il BAT viene eseguito solo in pazienti che hanno avuto risultati equivoci o discordanti per gli altri test allergici. Nel nostro studio sulle arachidi precedentemente citato, abbiamo confrontato le prestazioni del BAT con quelle di altri test allergologici eseguiti in parallelo. Il BAT ha dato risultati migliori dell’SPT, delle IgE specifiche alle arachidi e delle IgE specifiche all’Ara h 2 e ad altri componenti delle arachidi. Considerando i singoli test, il test diagnostico più accurato è stato il BAT. Per sfruttare al meglio le informazioni disponibili, i risultati del BAT possono essere utilizzati in combinazione con i risultati di altri test. Tuttavia, in generale, più test vengono utilizzati, maggiore è l’incertezza diagnostica (e il numero di OFC) dato che diversi test possono fornire risultati contraddittori. Meglio che combinare i risultati dei test allergologici simultaneamente può essere quello di utilizzare i BAT in sequenza nel work-up diagnostico delle allergie alimentari, in pazienti che hanno avuto un risultato inconcludente per gli altri test allergologici. Questo approccio può essere vantaggioso anche dal punto di vista della fattibilità, considerando gli aspetti pratici coinvolti nell’esecuzione del BAT, vale a dire la necessità di sangue fresco e le risorse e le competenze tecniche richieste. Non sarebbe pratico o addirittura necessario eseguire il BAT in tutti i pazienti che vengono indagati per sospetta allergia alimentare. Il BAT può essere riservato a casi selezionati, in particolare ai casi in cui non vi è una storia di esposizione orale all’alimento o la storia clinica non è chiara e i risultati della SPT e delle IgE specifiche sono inconcludenti. Il BAT potrebbe essere utilizzato come secondo passo nel work-up diagnostico, dopo la storia clinica e la SPT e/o le sIgE, nei casi difficili, prima di decidere se è necessario un OFC -Fig. 5. L’accuratezza diagnostica e la superiorità del BAT rispetto allo skin prick test e alle IgE specifiche deve essere valutata con altri allergeni e in altri contesti clinici.

Oltre a distinguere i pazienti allergici agli alimenti da quelli tolleranti agli alimenti, i risultati del BAT possono fornire ulteriori informazioni sulle caratteristiche delle reazioni indotte dagli alimenti che possono essere utili nella gestione dei pazienti allergici. È stato dimostrato che diversi parametri del BAT riflettono diverse caratteristiche delle reazioni allergiche, con la proporzione di basofili attivati (reattività dei basofili) che riflette la gravità dei sintomi allergici e la dose alla quale i basofili reagiscono all’allergene in vitro (sensibilità dei basofili) che riflette la dose di proteina alimentare alla quale i pazienti hanno reagito durante l’OFC. Questi risultati nell’allergia alle arachidi sono stati riprodotti in uno studio pubblicato successivamente e possono essere applicabili ad altre allergie alimentari. In ogni caso, il risultato del BAT dovrebbe essere preso nel contesto di altre caratteristiche cliniche e fattori di rischio per la gravità, quando si valutano i pazienti allergici agli alimenti.

Utilizzare il test di attivazione dei basofili per monitorare l’acquisizione della tolleranza agli alimenti e la risposta clinica ai trattamenti immunomodulatori per l’allergia alimentare

Riflette da vicino il fenotipo clinico dei pazienti allergici e tolleranti, Il BAT può essere utile per valutare la risoluzione naturale delle allergie alimentari che sono comunemente superate nel tempo, come le allergie al latte di mucca, alle uova e al grano, e per determinare quando ricontattare i pazienti per valutare se l’alimento può essere reintrodotto nella dieta. Il BAT ha dimostrato di distinguere diversi fenotipi di pazienti con allergie al latte vaccino e alle uova, vale a dire i pazienti che tollerano le forme ampiamente riscaldate di questi alimenti mentre reagiscono ancora agli alimenti non riscaldati dai pazienti che reagiscono sia al latte o alle uova ampiamente riscaldati che non riscaldati. In generale, negli studi di immunoterapia ad alimenti come arachidi, latte vaccino e uova, il BAT ha mostrato una diminuzione della reattività dei basofili ai rispettivi allergeni alimentari con il trattamento, che è particolarmente evidente alle concentrazioni più basse dell’allergene, riflettendo la diminuzione della sensibilità dei basofili. È interessante notare che Thyagarajan et al. hanno dimostrato che, durante l’OIT alle arachidi, la riduzione dell’attivazione dei basofili non avveniva solo in risposta alle arachidi, ma anche all’allergene dell’uovo (nei pazienti allergici alle uova) e all’anti-IgE ma non al controllo positivo non mediato dalle IgE, fMLP (formil-metionil-leucil-fenilalanina), suggerendo che il percorso a valle del recettore IgE era diventato anergico. In uno studio sull’omalizumab in pazienti allergici alle arachidi, l’espressione di CD203c nel BAT è diminuita durante il trattamento ed è tornata ai livelli pre-trattamento dopo la cessazione di questa terapia. Infine, il medicinale a base di erbe cinesi FAHF-2 ha anche mostrato un effetto inibitorio significativo nella risposta dei basofili in pazienti con allergia a diversi alimenti in parallelo con il miglioramento clinico.

Insieme, questi studi illustrano che il BAT può essere ripetuto negli stessi pazienti nel tempo per valutare i cambiamenti nella risposta immunitaria agli allergeni alimentari con qualche tipo di intervento, sia esso immunoterapia orale, immunoterapia sublinguale, omalizumab, o altre strategie terapeutiche o preventive immunomodulanti.

Previsioni future

Con l’obiettivo di applicare il BAT alla diagnosi di allergia alimentare nella pratica clinica, sono necessarie ulteriori ricerche per definire e convalidare i cut-off diagnostici per allergeni specifici e in diverse popolazioni di pazienti. La standardizzazione delle procedure di laboratorio sarebbe importante per permettere la comparabilità dei risultati del BAT tra centri diversi. Questo richiederebbe la standardizzazione del protocollo per il test in vitro e dei metodi di citometria a flusso e di analisi dei dati. L’uso di una metodologia simile per il BAT permetterebbe di confrontare i risultati del BAT in diversi centri, sia per scopi clinici che di ricerca, anche in studi multicentrici.

Una volta adeguatamente convalidato per la diagnosi di allergie alimentari specifiche, il BAT può essere utilizzato per monitorare la risposta clinica ai trattamenti immunomodulatori come l’immunoterapia allergene-specifica e i prodotti biologici. Il BAT ha anche un enorme potenziale per gli studi meccanicistici per migliorare la nostra comprensione del ruolo dei basofili nei meccanismi immunitari dell’allergia alimentare e della tolleranza alimentare.