U.S. Food and Drug Administration

Luglio 2000

Principi tossicologici per la valutazione della sicurezza degli ingredienti alimentariRedbook 2000Capitolo IV.C.1.d. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test

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I. Introduzione

I micronuclei sono corpi citoplasmatici contenenti cromatina che si formano quando frammenti di cromosomi acentrici o cromosomi rimangono indietro durante l’anafase e non riescono ad essere incorporati nei nuclei delle cellule figlie durante la divisione cellulare. Poiché il danno genetico che risulta in rotture cromosomiche, cromosomi strutturalmente anormali o anomalie del fuso porta alla formazione di micronuclei, l’incidenza dei micronuclei serve come indice di questi tipi di danno. È stato stabilito che essenzialmente tutti gli agenti che causano rotture cromosomiche a doppio filamento (clastogeni) inducono micronuclei. Poiché l’enumerazione dei micronuclei è molto più veloce e meno tecnicamente impegnativa del punteggio delle aberrazioni cromosomiche, e poiché i micronuclei derivano da due importanti tipi di danno genetico (clastogenesi e rottura del fuso), il test dei micronuclei è stato ampiamente utilizzato per lo screening delle sostanze chimiche che causano questi tipi di danno.

Questa guida riguarda il test dei micronuclei in vivo più ampiamente utilizzato: il test dei micronuclei di eritrociti di mammifero. Questo test dei micronuclei in vivo viene utilizzato per rilevare i danni indotti dalla sostanza in esame ai cromosomi o all’apparato mitotico degli eritroblasti mediante l’analisi degli eritrociti campionati nel midollo osseo e/o nelle cellule del sangue periferico degli animali, solitamente roditori.

Lo scopo del test dei micronuclei è quello di identificare le sostanze che causano danni citogenetici che portano alla formazione di micronuclei contenenti frammenti di cromosomi in ritardo o cromosomi interi.

Quando un eritroblasto del midollo osseo si sviluppa in un eritrocita policromatico, il nucleo principale viene estruso; i micronuclei che si sono formati possono rimanere nel citoplasma altrimenti enucleato. La visualizzazione dei micronuclei è facilitata in queste cellule utilizzando tecniche di colorazione specifiche e perché mancano di un nucleo principale. Un aumento della frequenza di eritrociti policromatici micronucleati negli animali trattati è un’indicazione di danno cromosomico indotto.

II. Definizioni

Centromero (cinetocoro) è una regione (o regioni) di un cromosoma con cui le fibre del fuso sono associate durante la divisione cellulare, permettendo il movimento ordinato dei cromosomi figli verso i poli delle cellule figlie.

I micronuclei sono piccoli nuclei, separati e aggiuntivi ai nuclei principali delle cellule, prodotti durante la telofase della mitosi (meiosi) da frammenti di cromosoma in ritardo o cromosomi interi.

L’eritrocita normocromatico è un eritrocita maturo che manca di ribosomi e può essere distinto dagli eritrociti immaturi e policromatici mediante colorazioni selettive per i ribosomi.

L’eritrocita policromatico è un eritrocita immaturo, in uno stadio intermedio di sviluppo, che contiene ancora ribosomi e quindi può essere distinto dagli eritrociti maturi, normocromatici, da colorazioni selettive per i ribosomi.

III. Considerazioni iniziali

Il midollo osseo dei roditori è usato abitualmente in questo test poiché gli eritrociti policromatici sono prodotti in quel tessuto. La misurazione degli eritrociti immaturi (policromatici) micronucleati nel sangue periferico è ugualmente accettabile in qualsiasi specie in cui sia stata dimostrata l’incapacità della milza di rimuovere gli eritrociti micronucleati, o che abbia dimostrato una sensibilità adeguata a rilevare gli agenti che causano aberrazioni cromosomiche strutturali e/o numeriche. I micronuclei possono essere distinti da una serie di criteri. Questi includono l’identificazione della presenza o assenza di un cinetocoro o di un DNA centromerico nei micronuclei. La frequenza di eritrociti immaturi (policromatici) micronucleati è il punto finale principale. Il numero di eritrociti maturi (normocromatici) nel sangue periferico che contengono micronuclei tra un dato numero di eritrociti maturi può anche essere usato come endpoint del test quando gli animali sono trattati continuamente per un periodo che supera la durata della vita dell’eritrocita nella specie in esame (ad esempio, 4 settimane nel topo), a condizione che non si verifichi una significativa selezione splenica contro gli eritrociti micronucleati in quella specie/razza. Le conseguenze della selezione splenica, se si verifica, dovrebbero essere pienamente affrontate.

Questo test in vivo sui micronuclei nei mammiferi è particolarmente importante per valutare il pericolo mutageno in quanto permette di considerare i fattori del metabolismo in vivo, la farmacocinetica e i processi di riparazione del DNA, sebbene questi possano variare tra le specie, tra i tessuti e tra gli endpoint genetici. Un test in vivo è anche utile per ulteriori indagini su un effetto mutageno rilevato da un sistema in vitro.

Se c’è la prova che la sostanza in esame, o un metabolita reattivo, non raggiungerà il tessuto bersaglio, non è opportuno utilizzare questo test.

IV. Principio del metodo di prova

Gli animali sono esposti alla sostanza in esame attraverso una via appropriata. Se si utilizza il midollo osseo, gli animali vengono sacrificati in momenti appropriati dopo il trattamento, il midollo osseo viene estratto e vengono effettuate e colorate le preparazioni.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Se si usa il sangue periferico, il sangue viene raccolto in momenti appropriati dopo il trattamento e vengono fatte e colorate preparazioni di striscio.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) I preparati vengono analizzati per la presenza di micronuclei.

V. Descrizione del metodo

A. Preparati

1. Selezione delle specie animali

Storicamente, i topi o i ratti sono stati usati abitualmente per questo test. Se il midollo osseo è il tessuto campionato, può essere usata qualsiasi specie appropriata di mammifero (vedi sezione III., sopra). Come per qualsiasi studio tossicologico, la selezione della specie appropriata dovrebbe essere giustificata. Quando si usa il sangue periferico, si raccomandano i topi. Tuttavia, si può usare qualsiasi specie appropriata di mammifero, purché si tratti di una specie in cui la milza non rimuove gli eritrociti micronucleati o di una specie che abbia dimostrato una sensibilità adeguata per individuare agenti che causano aberrazioni cromosomiche strutturali e/o numeriche. Devono essere impiegati ceppi di laboratorio comunemente usati di giovani animali sani. All’inizio dello studio, la variazione di peso degli animali dovrebbe essere minima e non superare il ±20% del peso medio di ciascun sesso.

2. Condizioni di alloggiamento e alimentazione

La temperatura nella stanza degli animali da esperimento dovrebbe essere adeguata alle specie utilizzate; per topi e ratti dovrebbe essere 22°C (±3°C). Anche se l’umidità relativa dovrebbe essere almeno del 30% e preferibilmente non superare il 70% se non durante la pulizia della stanza, l’obiettivo dovrebbe essere del 50-60%. L’illuminazione dovrebbe essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Per l’alimentazione, si possono usare diete convenzionali da laboratorio con una fornitura illimitata di acqua potabile. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire una miscela adeguata di una sostanza di prova quando somministrata per questa via. Gli animali possono essere alloggiati individualmente o in piccoli gruppi dello stesso sesso.

3. Preparazione degli animali

Gli animali adulti giovani e sani dovrebbero essere assegnati a caso ai gruppi di controllo e di trattamento. Gli animali devono essere identificati in modo univoco. Gli animali devono essere acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni. Le gabbie dovrebbero essere disposte in modo tale da ridurre al minimo i possibili effetti dovuti al posizionamento della gabbia.

4. Preparazione delle dosi

Le sostanze in esame solide dovrebbero essere disciolte o sospese in solventi o veicoli appropriati e diluite, se necessario, prima di essere dosate agli animali. Le sostanze di prova liquide possono essere dosate direttamente o diluite prima del dosaggio. Si dovrebbero utilizzare preparazioni fresche della sostanza in esame, a meno che i dati sulla stabilità non dimostrino l’accettabilità della conservazione.

B. Condizioni del test

1. Solvente/mezzo disperdente

Il solvente/mezzo disperdente non dovrebbe produrre effetti tossici ai livelli di dose utilizzati e non dovrebbe essere sospettato di reazione chimica con la sostanza in esame. Se si utilizzano solventi/veicoli diversi da quelli comunemente impiegati, il loro uso dovrebbe essere supportato da dati di riferimento che ne indichino la compatibilità con la sostanza in esame e gli animali. Si raccomanda che, laddove appropriato, l’uso di un solvente/mezzo acquoso sia considerato per primo.

2. Controlli

I controlli positivi e negativi (solvente/mezzo) concomitanti dovrebbero generalmente essere inclusi per ogni sesso in ogni test condotto con roditori. Tuttavia, quando il test dei micronuclei è condotto come parte di uno studio di tossicità generale secondo le linee guida GLP, allora la verifica del dosaggio appropriato sarà effettuata tramite analisi chimica. In questi casi, il trattamento concomitante degli animali con un agente di controllo positivo può non essere necessario e il controllo delle procedure di colorazione e di punteggio può essere realizzato includendo adeguati campioni di riferimento ottenuti precedentemente da animali che non fanno parte dell’esperimento in corso. Negli studi con specie superiori, come primati o cani, i controlli positivi possono essere omessi a condizione che una risposta accettabile alle sostanze di controllo positivo delle specie utilizzate sia stata dimostrata in precedenza dal laboratorio di analisi. In tutti i casi, i controlli negativi concomitanti sono una componente obbligatoria dello studio. Tranne che per il trattamento con la sostanza in esame, gli animali dei gruppi di controllo dovrebbero essere trattati in modo identico agli animali dei gruppi di trattamento.

I controlli positivi dovrebbero produrre micronuclei in vivo a livelli di esposizione che dovrebbero dare un aumento rilevabile e statisticamente significativo rispetto al fondo. Le dosi dei controlli positivi dovrebbero essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l’identità dei vetrini codificati. È accettabile che il controllo positivo sia somministrato per una via diversa dalla sostanza in esame e campionato in un solo momento. Inoltre, può essere preso in considerazione l’uso di sostanze chimiche di controllo positivo correlate alla classe chimica, se disponibili. Esempi di sostanze di controllo positivo includono:

Animali di controllo negativi, trattati con il solo solvente o veicolo e altrimenti trattati allo stesso modo dei gruppi di trattamento, dovrebbero essere inclusi per ogni tempo di campionamento, eccetto che in circostanze appropriate può essere possibile utilizzare un animale come proprio controllo confrontando i campioni pre-trattamento e post-trattamento. Se si applica il campionamento singolo per i controlli negativi, il tempo di campionamento scelto dovrebbe essere giustificato. Inoltre, anche i controlli non trattati dovrebbero essere usati a meno che non ci siano (a) dati disponibili dal laboratorio di prova, o (b) dati di controllo storici o pubblicati che dimostrino che nessun effetto deleterio o mutageno è indotto dal solvente/veicolo scelto.

Se si usa il sangue periferico, un campione pre-trattamento può anche essere accettabile come controllo negativo concomitante, ma solo negli studi brevi sul sangue periferico (es, 1-3 trattamenti) quando i dati risultanti sono nell’intervallo previsto per il controllo storico e quando è stata dimostrata l’assenza di un effetto solvente.

VI. Procedura per ratti e topi

Le seguenti sezioni forniscono indicazioni per le procedure nei topi e nei ratti, le specie più comunemente utilizzate in questo test.

A. Numero e sesso degli animali

Ogni gruppo trattato e di controllo dovrebbe includere almeno 5 animali analizzabili per sesso.(12) Se al momento dello studio ci sono dati disponibili da studi sulla stessa specie e utilizzando la stessa via di esposizione che dimostrano che non ci sono differenze sostanziali tra i sessi nella tossicità, allora sarà sufficiente testare un solo sesso.

B. Schema di trattamento

Si possono raccomandare diversi schemi di trattamento (cioè 1, 2 o più trattamenti a intervalli di 24 ore). I campioni provenienti da regimi a dosi estese sono accettabili a condizione che sia stato dimostrato un effetto positivo per questo studio o, per uno studio negativo, a condizione che sia stata dimostrata la tossicità o che sia stata utilizzata la dose limite (vedi sezione “D”, sotto) e il dosaggio sia continuato fino al momento del campionamento. Questo si basa su studi che dimostrano che le esposizioni ripetute di topi e ratti fino alla durata subcronica hanno prodotto effetti di una grandezza simile a quelli ottenuti con il tradizionale saggio acuto.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Tuttavia, poiché c’è una certa preoccupazione che la sensibilità possa essere ridotta in studi a lungo termine a causa del mancato raggiungimento di una vera MTD, o perché può verificarsi un adattamento, si ritiene attualmente che la durata del trattamento debba essere limitata a quattro settimane fino a quando la sensibilità del test non sarà confermata quando verranno utilizzati trattamenti più lunghi.(12)

Le sostanze in esame possono anche essere somministrate come dose frazionata, cioè due o più trattamenti nello stesso giorno separati da non più di qualche ora, per facilitare la somministrazione di un grande volume di materiale o per minimizzare le fluttuazioni dei livelli ematici dell’articolo da testare.

Due modi in cui il test può essere eseguito sono:

• Gli animali sono trattati con la sostanza da testare una o due volte ad un intervallo non superiore alle 24 ore. I campioni di midollo osseo sono prelevati almeno due volte tra 24 e 48 ore dopo l’ultima dose, con un intervallo appropriato tra i campioni. L’uso di tempi di campionamento precedenti alle 24 ore dopo il trattamento deve essere giustificato. I campioni di sangue periferico sono prelevati almeno due volte tra le 36 e le 72 ore dopo l’ultimo trattamento, con intervallo/i appropriato/i tra i campioni. Quando viene riconosciuta una risposta positiva ad un tempo di campionamento, non è necessario un ulteriore campionamento.
• Se si usano tre o più trattamenti giornalieri (per esempio, tre o più trattamenti a intervalli di 24 ore), i campioni possono essere raccolti una volta entro 24 ore dal trattamento finale per il midollo osseo e una volta entro 40 ore dal trattamento finale per il sangue periferico.(12), (20)

Si possono usare altri tempi di campionamento, se pertinenti e scientificamente giustificati.

C. Livelli di dose

Se si esegue uno studio di ricerca dell’intervallo di dose perché non ci sono dati adatti disponibili, dovrebbe essere eseguito nello stesso laboratorio, usando la stessa specie, ceppo, sesso e regime di trattamento da usare nello studio principale.(7) Se c’è tossicità, tre livelli di dose dovrebbero essere usati per il primo tempo di campionamento. Questi livelli di dose dovrebbero coprire una gamma che va da una tossicità evidente a una tossicità minima o nulla. Per i campionamenti successivi si deve usare solo la dose più alta. La dose più alta è definita come la dose che produce segni di tossicità tali che livelli di dose più alti, basati sullo stesso regime di dosaggio, dovrebbero produrre letalità. Sostanze con attività biologiche specifiche a basse dosi non tossiche (come ormoni e mitogeni) possono essere eccezioni ai criteri di definizione della dose e dovrebbero essere valutate caso per caso. La dose più alta può anche essere definita come una dose che produce qualche indicazione di tossicità del midollo osseo (ad esempio, una riduzione della proporzione di eritrociti immaturi sul totale degli eritrociti nel midollo osseo o nel sangue periferico).

D. Test limite

Se non si verificano effetti tossici osservabili da un singolo trattamento con un livello di dose di almeno 2000 mg/kg di peso corporeo, o da due trattamenti nello stesso giorno, e se non ci si aspetta genotossicità sulla base dei dati di sostanze strutturalmente correlate, allora può non essere necessario uno studio completo con 3 livelli di dose. Per studi di più lunga durata, la dose limite è 2000 mg/kg/peso corporeo/giorno per trattamenti fino a 14 giorni, e 1000 mg/kg/peso corporeo/giorno per trattamenti superiori a 14 giorni. L’esposizione umana prevista può indicare la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato nel test limite.

E. Somministrazione delle dosi

La sostanza in esame viene solitamente somministrata mediante sonda gastrica o cannula di intubazione adatta, oppure mediante iniezione intraperitoneale. Altre vie di esposizione possono essere accettabili se possono essere giustificate. Il volume massimo di liquido che può essere somministrato tramite sonda gastrica o iniezione in una sola volta dipende dalle dimensioni dell’animale di prova. Il volume non dovrebbe superare i 2 ml/100g di peso corporeo. L’uso di volumi superiori a questi deve essere giustificato. Tranne che per le sostanze irritanti o corrosive, che normalmente riveleranno effetti esacerbati con concentrazioni più alte, la variabilità del volume del test dovrebbe essere minimizzata regolando la concentrazione per assicurare un volume costante a tutti i livelli di dose.

F. Preparazione del midollo osseo/sangue

Le cellule del midollo osseo sono solitamente ottenute dai femori o dalle tibie subito dopo il sacrificio. Comunemente, le cellule vengono rimosse dai femori o dalle tibie, preparate e colorate utilizzando metodi consolidati. Il sangue periferico è ottenuto dalla vena della coda o da un altro vaso sanguigno appropriato. Le cellule del sangue vengono immediatamente colorate in modo supravitale (4), (5), (14) oppure si preparano degli strisci e poi si colorano. L’uso di una macchia specifica per il DNA (ad esempio, arancio acridina(15) o Hoechst 33258 più pirronina-Y(30)) può eliminare alcuni degli artefatti associati all’uso di una macchia non specifica per il DNA. Questo vantaggio non preclude l’uso di macchie convenzionali (per esempio, Giemsa). Sistemi aggiuntivi (ad es, colonne di cellulosa per rimuovere le cellule nucleate(36)) possono anche essere utilizzati a condizione che questi sistemi abbiano dimostrato di funzionare adeguatamente per la preparazione dei micronuclei in laboratorio.

G. Analisi

La proporzione di eritrociti immaturi sul totale (immaturi + maturi) è determinata per ogni animale contando un totale di almeno 200 eritrociti per il midollo osseo e 1000 eritrociti per il sangue periferico.(9) Tutti i vetrini, compresi quelli dei controlli positivi e negativi, devono essere codificati indipendentemente prima dell’analisi microscopica. Almeno 2000 eritrociti immaturi per animale sono valutati per l’incidenza di eritrociti immaturi micronucleati. Ulteriori informazioni possono essere ottenute valutando gli eritrociti maturi per i micronuclei. Quando si analizzano i vetrini, la proporzione di eritrociti immaturi sul totale degli eritrociti non dovrebbe essere inferiore al 20% del valore di controllo. Quando gli animali sono trattati continuamente per 4 settimane o più, almeno 2000 eritrociti maturi per animale possono anche essere valutati per l’incidenza di micronuclei. I sistemi per l’analisi automatizzata (analisi delle immagini o analisi citometrica a flusso delle sospensioni cellulari) sono alternative accettabili alla valutazione manuale se adeguatamente giustificate e convalidate rispetto al punteggio microscopico classico.(12)

VII. Procedura per specie diverse da ratti e topi

Informazioni pubblicate basate su studi in topi, ratti, criceti, maiali, cani, primati non umani e umani(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) indicano che le frequenze spontanee e indotte di eritrociti micronucleati sono simili nella maggior parte delle specie di mammiferi e suggeriscono che la misurazione dell’incidenza di eritrociti immaturi micronucleati nel midollo osseo è appropriata per valutare il danno cromosomico o al fuso in quelle specie studiate finora. La comparsa e la scomparsa di eritrociti micronucleati nel midollo osseo è una funzione della cinetica dell’eritrogenesi e della durata della vita degli eritrociti in ogni specie, e quindi i regimi di dosaggio e campionamento devono essere modificati in conformità con i parametri appropriati della cinetica eritrocitaria per ogni specie. Specie diverse dal topo o dal ratto possono essere utilizzate quando è appropriato, ma devono essere incluse le seguenti informazioni:

• Giustificazione della specie selezionata e dei programmi di dosaggio e campionamento utilizzati in relazione alla cinetica dell’eritropoiesi e alla durata della vita degli eritrociti nelle specie utilizzate;
• Prova che la frequenza dei micronuclei spontanei è coerente con le informazioni pubblicate, e/o coerente all’interno del laboratorio che conduce lo studio;
• Prova che i genotossici noti producono un aumento della frequenza dei micronuclei nelle specie utilizzate e valori di riferimento per l’entità della risposta indotta;
• Impatto della rimozione selettiva splenica delle cellule micronucleate dal sangue periferico (quando quest’ultimo serve come tessuto da monitorare).

VIII. Dati e rapporti

A. Risultati del trattamento

I dati dei singoli animali devono essere presentati in forma tabellare. L’unità sperimentale è l’animale. Il numero di eritrociti immaturi segnati, il numero di eritrociti immaturi micronucleati, e il numero di immaturi tra gli eritrociti totali devono essere elencati separatamente per ogni animale analizzato. Quando gli animali sono trattati continuamente per 4 settimane o più, i dati sugli eritrociti maturi dovrebbero essere forniti anche se sono stati raccolti. La proporzione di immaturi tra gli eritrociti totali e, se ritenuto applicabile, la percentuale di eritrociti maturi micronucleati dovrebbe essere fornita per ogni animale. Se non ci sono prove di una differenza di risposta tra i sessi, i dati di entrambi i sessi possono essere combinati per l’analisi statistica.

B. Valutazione e interpretazione dei risultati

Ci sono diversi criteri per determinare un risultato positivo, come un aumento correlato alla dose del numero di cellule micronucleate o un chiaro aumento del numero di cellule micronucleate in un singolo gruppo di dosi in un singolo momento del campionamento. I metodi statistici devono essere usati per valutare i risultati del test.(24),(35) I criteri statistici per un risultato positivo, negativo o equivoco devono essere indicati chiaramente nel protocollo. Poiché i fattori biologici possono modificare l’interpretazione, la significatività statistica non dovrebbe essere l’unico fattore determinante per raggiungere una conclusione. I risultati equivoci dovrebbero essere chiariti da ulteriori test, utilizzando una modifica delle condizioni sperimentali, se appropriato.

Anche se la maggior parte degli esperimenti darà risultati chiaramente positivi o negativi, in rari casi l’insieme dei dati preclude un giudizio definitivo sull’attività della sostanza in esame. I risultati possono rimanere equivoci o discutibili indipendentemente dal numero di volte che l’esperimento viene ripetuto.

I risultati positivi nel test dei micronuclei indicano che una sostanza induce micronuclei, che sono il risultato di danni cromosomici o danni all’apparato mitotico negli eritroblasti della specie in esame. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni del test, la sostanza in esame non produce danni cromosomici o al fuso che portano alla formazione di micronuclei negli eritrociti immaturi della specie in esame.

La probabilità che la sostanza in esame o i suoi metaboliti raggiungano la circolazione generale o specificamente il tessuto bersaglio (ad esempio, tossicità sistemica) dovrebbe essere discussa. La dimostrazione di un’adeguata esposizione del tessuto bersaglio in un test negativo sui micronuclei è una considerazione particolarmente importante quando vi sono prove positive di genotossicità in uno o più altri sistemi di test.

C. Rapporto di prova

Il rapporto di prova dovrebbe includere anche le seguenti informazioni:

1. Sostanza di prova

• dati di identificazione e numero CAS, se noto
• natura fisica e purezza
• proprietà fisico-chimiche rilevanti per lo svolgimento dello studio
• stabilità della sostanza in esame, se nota

2. Solvente/veicolo

• giustificazione della scelta del veicolo
• solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/veicolo, se note

3. Soluzioni di dosaggio

• tempi in cui le soluzioni di dosaggio sono state preparate e utilizzate (o intervallo tra la preparazione e l’utilizzo), e condizioni di conservazione
• dati che verificano la concentrazione della soluzione di dosaggio, se disponibili

4. Animali di prova

• specie/ceppo utilizzati, compresa la giustificazione
• numero, età e sesso degli animali
• fonte, condizioni di alloggio, dieta, ecc.
• peso individuale degli animali all’inizio del test, compresa la gamma di peso corporeo, la media e la deviazione standard per ogni gruppo
• informazioni riguardanti la potenziale influenza della selezione splenica sull’incidenza di cellule micronucleate nel sangue periferico, se applicabile

5. Condizioni del test

• dati di controllo positivi e negativi (veicolo/solvente)
• dati dello studio di ricerca, se condotto
• ragionamento per la selezione del livello di dose
• dettagli della preparazione della sostanza in esame
• dettagli della somministrazione della sostanza in esame
• ragionamento della via di somministrazione e del regime di dosaggio
• metodi per verificare che la sostanza in esame abbia raggiunto la circolazione generale e/o il tessuto target, se applicabile
• conversione dalla concentrazione della sostanza in esame nella dieta/acqua potabile (ppm) alla dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno), se applicabile
• dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua
• descrizione dettagliata del trattamento e dei programmi di campionamento
• metodi di preparazione dei vetrini
• metodi di misurazione della tossicità
• criteri per il punteggio degli eritrociti immaturi micronucleati e, se appropriato e applicabile, eritrociti maturi
• numero di cellule analizzate per animale
• criteri per considerare gli studi positivi, negativi o equivoci

6. Risultati

• segni di tossicità
• proporzione di eritrociti immaturi sul totale degli eritrociti
• numero di eritrociti immaturi micronucleati sul totale degli eritrociti immaturi, dato separatamente per ogni animale
• se appropriato e applicabile, numero di eritrociti maturi micronucleati sul totale degli eritrociti maturi, dati separatamente per ogni animale
• media ± deviazione standard degli eritrociti immaturi micronucleati e, se applicabile, degli eritrociti maturi per gruppo
• relazione dose-risposta, dove possibile
• analisi statistiche e giustificazione del metodo applicato, con appropriata citazione della letteratura
• dati di controllo negativi attuali e storici
• dati di controllo positivi attuali e storici

7. Discussione dei risultati

8. Conclusione

XI. Addendum: Identificazione dei micronuclei derivati da frammenti acentrici e cromosomi centromerici

I micronuclei possono essere formati da frammenti acentrici o da interi cromosomi in ritardo nella mitosi. Questi ultimi micronuclei sono stati inizialmente riconosciuti per le loro grandi dimensioni,(49) tramite C-banding(47) o tramite la misurazione del contenuto di DNA.(46) Tuttavia, questi metodi non erano molto affidabili. Pertanto, sono stati sviluppati due metodi di citogenetica molecolare per identificare la presenza di centromeri nei micronuclei e quindi differenziare tra micronuclei di origine clastogenica e aneugenica:(12) 1) colorazione CREST immunofluorescente e 2) ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) con sonde DNA pancentromeriche. Quando è meccanicamente importante determinare la presenza del cinetocoro o del centromero nei micronuclei, questi metodi possono essere applicati.

Il metodo CREST applicato al test dei micronuclei del midollo osseo è descritto in dettaglio da Miller e Adler.(33) Le cellule su vetrini (strisci di midollo osseo normale) sono fissate, disidratate, incubate in due fasi con SDS e Triton-X, e poi colorate con anticorpo. Il DNA è controcolorato con Hoechst 33258.

Con la FISH, la sonda del DNA satellite minore che si ibrida vicino al centromero(43) è usata per identificare la regione centromerica, se presente. Un metodo per il FISH con le sonde del DNA centromerico è stato descritto da Pinkel et al.(34) Questo metodo può essere applicato a eritrociti contenenti micronuclei selezionati a flusso(10) o a micronuclei isolati ottenuti da campioni di sangue periferico.(13)

Nei vetrini di controllo, il tasso di micronuclei etichettati contenenti la regione centromerica è circa il 50%.(43) Circa il 70% dei micronuclei indotti da aneugeni noti (colchicina e vinblastina) sono etichettati,(33) mentre quelli indotti da clastogeni (idrochinone e mitomicina C) mostrano solo il 5-15% di micronuclei etichettati.(33) Per caratterizzare l’attività clastogenica relativa rispetto a quella aneugenica di una sostanza chimica, è utile usare come indice il numero di eritrociti policromatici micronucleati su 1000 eritrociti policromatici che contengono la regione centromerica.(42)

La principale carenza dei metodi FISH descritti finora è che non differenziano tra eritrociti normocromatici e policromatici.(12) Pertanto, solo i preparati in cui una grande frazione dei micronuclei presenti è indotta dall’articolo in esame sono adatti all’analisi. Per esempio, i campioni di sangue periferico da esperimenti con esposizioni acute in animali adulti non sono essenzialmente mai adatti all’analisi perché la popolazione di cellule bersaglio (eritrociti immaturi) è solo il 3-5% degli eritrociti nel campione.

In conclusione, la marcatura CREST- o FISH sono considerati metodi affidabili per rilevare le proprietà aneugenetiche delle sostanze chimiche nel saggio dei micronuclei in vivo, a condizione che si presti attenzione a garantire che vengano utilizzati campioni appropriati per l’analisi.(12) Tuttavia, la complessità dei metodi attuali ne limita l’uso a quei casi in cui si sospetta che una sostanza chimica causi danni al fuso (ad es, a causa della presenza di grandi micronuclei, l’induzione della poliploidia, ecc.) o quando ci sono altre ragioni specifiche per ottenere questa informazione meccanicistica.

X. Riferimenti

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