Un RNA che produce DNA idrogel come piattaforma per un sistema di interferenza RNA ad alte prestazioni

Sintesi e caratterizzazione del I-gel

I quattro oligonucleotidi di X-DNA (X01-X04 filamenti di DNA) sono stati sintetizzati commercialmente da Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). Le sequenze di X-DNA (Tabella 5 supplementare) sono stati progettati, preparati e caratterizzati seguendo le stesse procedure come descritto nella letteratura con lievi modifiche 10,13. Liofilizzati filamenti di DNA in scala 1 μmol è stato raccolto mediante centrifugazione a 14.000 g per 15 s a temperatura ambiente. Ogni filamento di DNA è stato risospeso a 1,0 mM concentrazione in 1x TE buffer (pH 8,0). Ogni tubo è stato agitato e mescolato con MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) a 1500 rpm per ~ 3 ore per sciogliere completamente gli oligonucleotidi liofilizzati. In totale, 0,05 μmol (50 microlitri) di ogni filamento di DNA è stato combinato in una provetta da 1,5 ml, e l’acqua priva di nucleasi è stata aggiunta con il volume totale della miscela di oligonucleotidi a 500 microlitri. 100 μl di miscela di oligonucleotidi sono stati distribuiti in provette da 0,5 ml. Le provette sono state poste in un termociclatore (Bio-Rad, CA, USA). I quattro tipi di oligonucleotidi (X01 ~04) sono stati annealed con le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 min, e 65 ° C per 2 min, 60 ° C per 5,5 min, diminuzione di 1 ° C mantenendo 1 min a quella temperatura, 20 ° C per 30 s, e diminuire a 4 ° C per la stabilizzazione e la conservazione di X-DNA. Poi, per lo scambio di tamponi, la soluzione di X-DNA ricotto (500 microlitri) in una unità di filtraggio (3-kDa Mw cutoff) per la microcentrifugazione è stato centrifugato per 6 ore a 15.000 g e 4 ° C per ridurre il volume del solvente. L’unità di filtraggio è stata trasferita in una provetta da centrifuga fresca. In totale, 100 μl di acqua priva di nucleasi a 4 °C sono stati aggiunti all’unità filtrante. L’unità filtro è stato centrifugato per 4 h a 15.000 g e 4 ° C per risciacquare X-DNA di sali rimanenti. Il modulo del filtro cutoff deve essere messo a testa in giù nella provetta e centrifugato a 2000 g per 3 min a 4 °C. L’aggiunta di acqua priva di nucleasi e la centrifugazione sono state eseguite altre due volte utilizzando la stessa provetta da centrifuga per rimuovere completamente il sale residuo di X-DNA. Il volume finale della soluzione X-DNA sarà ~ 300 μl. Il plasmide di espressione siRNA (I-plasmide) è stato acquistato e maxi-preparato da Cosmo Genetech (Seoul, Corea del Sud). Per costruire gli I-gel, gli I-plasmidi sono stati linearizzati usando l’enzima di restrizione BamHI. La dimensione del gene siRNA era 66 bp con lo spaziatore (o 498 bp con il promotore T7) (vedi Figura 4 supplementare per la mappa I-plasmide). Le quantità di DNA dei campioni sono state determinate dal loro valore di assorbimento UV/Vis utilizzando un BioSpettrometro (Eppendorf, Amburgo, Germania). Il X-DNA e plasmidi lineari sono stati prima mescolati ad un rapporto molare predeterminato in presenza di T4 DNA ligasi (Promega, Madison, WI, USA) per sintetizzare il Dgel. Per un X-DNA: I-plasmide rapporto di 1500:1, abbiamo usato 10,5 μL di 75 μM X-DNA e 5,25 μL di 100 nM plasmide in un volume di reazione 30 μL. Per l’esperimento Blank-gel, la stessa quantità di materiale X-DNA come in I-gel è stato legato con T4 DNA ligasi. 10 µL di ogni campione sono stati mescolati con 2 µL di tampone di caricamento del gel e sono stati elettroforesi su un gel di agarosio allo 0,7 o al 2% a 100 V per 60 minuti. Tutti i DNA (X-DNA, I-plasmide, Blank-gel e I-gel) sono stati confermati mediante elettroforesi su gel di agarosio (figure supplementari 3, 11, 18). I Dgels sintetizzati sono stati desalinizzati due volte usando filtri centrifughi microtubolari Amicon 3-kDa Mw cutoff. Per la microscopia elettronica a scansione (SEM), i campioni sono stati liofilizzati in un liofilizzatore FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) fino a quando tutta l’acqua era stata rimossa. I campioni essiccati sono stati incrinati per rivelare le loro superfici fresche. Dopo essere stato sputter-rivestito con uno strato di 2 ~ 3-nm Pt per 100 s, le morfologie di queste superfici idrogel sono stati osservati a ~ 50.000 × ingrandimento utilizzando un S-3500N (Hitachi, Tokyo, Giappone) microscopio elettronico a scansione ad una tensione di accelerazione di 15 kV (Figura supplementare 19).

I-gel test di stabilità

Sette campioni sono stati preparati per ciascuno del plasmide libero I e I-gel. In ogni campione, 2 µL di I-plasmide libero (57 ng) o I-gel (gel 1:1500 contenente 57 ng di I-plasmide) sono stati diluiti in 12 µL di acqua distillata, quindi sono stati aggiunti 4 µL di tampone ottimizzato per la trascrizione 5 × e trattati con 3,33 × 10-5 unità di DNasi I (No. M6101; Promega) a 20 µL di volume finale, seguito da incubazione a 37 °C per 0, 1, 4, 12, 24 e 48 ore, rispettivamente. Dopo l’incubazione, i campioni da 20 µL sono stati separati in due aliquote da 10 µL, una per l’elettroforesi e un’altra per la successiva trascrizione. In ognuna delle aliquote, la reazione di denaturazione è stata terminata con l’aggiunta di 1 µL di soluzione RQ1 DNase stop e l’incubazione per 10 min a 65 °C. Successivamente, 10 µL di ogni campione sono stati mescolati con 2 µL di tampone di caricamento del gel e sottoposti a elettroforesi su un gel di agarosio al 2% a 100 V per 60 min (Figura 13 supplementare). Un’altra aliquota di ogni campione è stato utilizzato per la reazione di trascrizione per dimostrare l’efficienza di trascrizione di I-gel dopo la reazione di digestione. shRNA sono stati trascritti dal I-gel o libero I-plasmide modelli (0, 24, 48 h) utilizzando kit di trascrizione (Riboprobe; Promega) seguendo le istruzioni del produttore. Gli shRNA ottenuti sono stati quantificati mediante RT-qPCR come descritto nelle sezioni Preparazione dell’RNA totale e trascrizione inversa e PCR in tempo reale e analisi dei dati (Tabella 4 supplementare).

Analisi dell’espressione e inibizione delle proteine

I kit di trascrizione e traduzione accoppiati (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, catalogo n. 88882) sono stati acquistati da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), e le reazioni sono state effettuate seguendo le procedure suggerite dal produttore. In breve, il lisato di cellule HeLa, le proteine accessorie, la miscela di reazione e il plasmide pcDNA3.1( + ) IRES GFP (0,5 μg/μL; No. 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) sono stati miscelati in un 12,5:2.5:5:2 (v / v) rapporto e incubato a 30 ° C per 1, 2, 4, e 6 ore. Dopo i tempi di reazione indicati, le soluzioni campione sono stati incubati per 24 ore a 4 ° C sia per fermare la reazione e garantire un tempo sufficiente ripiegamento della proteina. Per valutare l’efficienza di interferenza, libero I-plasmide o I-gel è stato aggiunto al lisato cellulare in presenza di 1000 ng di plasmide GFP. Negli esperimenti di controllo per la condizione ottimizzata I-gel contenente 57 ng di I-plasmide (17,5 nmol), scrambled shRNA (17,5 nmol e 1,75 μmol; 1 eq e 100 eq alla quantità di I-plasmide, rispettivamente) (SN-1003; Bioneer, Seoul, Corea), miscela di plasmide scrambled (17.5 nmol; scrambled shRNA miscela di plasmidi di espressione; Cosmo Genetech), scrambled gel plasmide (miscela di plasmidi scrambled enzimaticamente reticolato con X-DNA), l’I-gel componente (X-DNA solo, I-plasmide solo, o queste miscele senza reticolazione enzimatica, cioè, nessuna formazione di gel), o Blank-gel (reticolazione enzimatica di X-DNA solo) sono stati aggiunti direttamente alla soluzione di espressione GFP. Tutte le reazioni sono state eseguite almeno tre volte. Se non diversamente specificato, il volume di reazione è stato mantenuto a 25 μL. Gli spettri di fluorescenza sono stati analizzati utilizzando uno spettrofluorofotometro (FluoroMate FS-2; SCINCO Co, Seoul, Corea) per determinare il livello di espressione GFP nella soluzione del lisato cellulare.

Preparazione dell’RNA totale e trascrizione inversa

Come controllo spike-in, 3 µL di cel-miR-39 (33 fmol/µL; No. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada) è stato aggiunto a tutti i lisati cellulari preespressi (20 µL) prima dell’estrazione dell’RNA. Quindi, l’RNA totale è stato estratto da 23 µL del lisato usando il reagente TRIzol (Ambion, Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. L’RNA totale estratto è stato sciolto in 10 µL di acqua trattata con DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Quindi, 2 µL di RNA totale sono stati poliadenilati con 1 mM ATP in 1 × poly(A) polymerase buffer contenente 5 U di Escherichia coli poly(A) polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a 37 °C per 30 min in una miscela di reazione da 20 µL. Per la trascrizione inversa, 4 µL di RNA sono stati mescolati con 1 pmol di primer RT e 0,5 mM di miscela dNTP e poi portati a un volume di 13 µL con acqua trattata con DEPC. La miscela è stata riscaldata a 65 °C per 5 minuti e poi raffreddata rapidamente su ghiaccio. La miscela di reazione è stata poi portata a un volume finale di 20 µL con l’aggiunta di 5 mM di ditiotreitolo, 1 × buffer first-strand, 40 U di inibitore della RNasi e 200 U di SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e incubata a 50 °C per 1 h, seguita da inattivazione enzimatica a 70 °C per 15 min. Le sequenze di primer RT (vedi Tabella 5 supplementare) sono stati progettati per la sintesi di cDNA dalla sequenza di RNA. Il primer utilizzato è stato l’adattatore 3′ RACE, che è fornito nel kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Tutti i primer sono stati sintetizzati da Cosmo Genetech, tranne il primer cel-miR-39 forward (Norgen Biotek Corp.). Il tasso di recupero dell’RNA in ogni soluzione lisata è stato stimato dalla differenza tra il valore CT del controllo spike-in ottenuto e quello del riferimento cel-miR-39 (non proceduto con il processo di estrazione).

PCR in tempo reale e analisi dei dati

Le quantità di shRNA e mRNA GFP sono state quantificate mediante qPCR utilizzando il sistema StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La qPCR di ogni campione è stata eseguita in un volume totale di 20 µL con 2 µL di cDNA, 10 µL di 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) e 10 pmol di ogni primer. L’amplificazione è stata eseguita nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 min e 30 cicli di 95 °C per 15 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 30 s. La qPCR è stata eseguita anche con cel-miR-39 come RNA di riferimento per ottenere il tasso di recupero dell’RNA totale in ogni campione. Il protocollo qPCR è stato lo stesso di quello descritto sopra in questa sezione, fatta eccezione per i primer utilizzati, che erano 10 pmol di un primer inverso comune (lo stesso del primer inverso shRNA) e cel-miR-39 primer avanti. La curva di fusione di ogni prodotto di DNA amplificato è stato ottenuto misurando il cambiamento di intensità di fluorescenza del colorante SYBR Green per sei volte per campione mentre aumentava la temperatura da 60 ° C a 95 ° C ad una velocità di + 0,3 ° C / s dopo il completamento della qPCR. I primer specifici per la qPCR sono stati progettati utilizzando il programma Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (Tabella supplementare 5). L’espressione relativa degli obiettivi è stata determinata usando il metodo comparativo 2-ΔΔCT. La quantità relativa di GFP mRNA è stata anche confermata attraverso la misurazione dell’intensità della banda sul gel di agarosio al 2%. L’amplificazione del cDNA è stata eseguita con le stesse condizioni di PCR e lo stesso programma usato per la qPCR descritta sopra, tranne che per il numero di cicli di PCR (20 per GFP mRNA).

Calibrazione e quantificazione della quantità assoluta di RNA

Le curve standard per la concentrazione di RNA e il valore CT sono state ottenute usando ogni materiale standard di RNA. Per l’shRNA, la curva standard è stata ottenuta utilizzando shRNA sintetizzati acquistati da Integrated DNA Technologies. Per l’mRNA GFP, la curva è stata ottenuta utilizzando l’mRNA GFP estratto da un kit di trascrizione (Riboprobe; Promega) secondo le istruzioni del produttore. La quantità di RNA dello shRNA standard è stata informata da Integrated DNA Technologies, mentre quella dell’mRNA GFP standard estratto è stata determinata dal suo valore di assorbimento UV/Vis usando il BioSpectrometer. Gli RNA standard ottenuti sono stati convertiti in cDNA mediante trascrizione inversa, come descritto sopra nella sezione “Preparazione dell’RNA totale e trascrizione inversa”. Dopo di che, il cDNA è stato diluito 10, 100, 1000, e 10.000 volte, e poi la qPCR è stata ripetuta tre volte, e i valori CT ottenuti sono stati utilizzati per ottenere una curva standard. I valori CT ottenuti dalla RT-qPCR sono stati convertiti nelle concentrazioni iniziali di RNA nei lisati cellulari attraverso un processo di calibrazione (Figura 6 supplementare). La quantità assoluta finale di RNA è stata determinata moltiplicando ogni tasso di recupero di RNA (%) e il valore della quantità di RNA dalla curva di calibrazione (Tabelle supplementari 1, 2).

L’etichettatura cellulare con Cy5-I-gel

Le cellule Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sono state ottenute dalla Korea Cell Line Bank (Seoul, Corea) e mantenute in DMEM integrato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina in un incubatore umido e con CO2 (5%). Le cellule MDCK che esprimono GFP (MDCK-GFP) sono state preparate trasfettando il vettore pEGFP-N1 nelle cellule con l’uso di reagenti Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific) secondo il protocollo del produttore. In seguito, abbiamo selezionato le cellule che emettono GFP usando il sistema FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Durante tutta la ricerca, le cellule sono state testate negativamente per la contaminazione da micoplasma. Le cellule MDCK-GFP coltivate in piastre da 24 pozzetti con coprioggetti (50.000 cellule per ogni pozzetto) sono state fatte coincidere con il Cy5-I-gel (Cy5-coniugato I-gel) contenente filamenti di sequenza di DNA X01 coniugati con Cy5 (corrispondenti a 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) in terreno privo di siero per 4 h. Per preparare il Cy5-I-plasmide, Cy5-dsDNA (Cy5-coniugato dsDNA) è stato prima preparato da Cy5-coniugato X01 annealing (con un ulteriore 5′-p-GATC fine appiccicoso) e il suo complementare contro-filo (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Poi, il Cy5-dsDNA e I-plasmide sono stati mescolati e legati ad un rapporto molare di 5000:1. Eccesso non legato Cy5-dsDNA è stato rimosso mediante centrifugazione (12.400 g, 4 ° C, 60 min) utilizzando Amicon filtri microtubolari centrifuga (50 kDa Mw cutoff) per 4-5 volte. Il Cy5-shRNA (Cy5-coniugato shRNA) è stato sintetizzato commercialmente (Integrated DNA Technologies). Per il Cy5-I-plasmide e Cy5-shRNA set, le cellule sono state fatte coincidere con 2,625 nM di ciascun campione in mezzo privo di siero per 4 ore. Per il Lipofectamine-Cy5-I-plasmide e Lipofectamine-Cy5-shRNA set, Lipofectamine e il Cy5-coniugato campione sono stati elettrostaticamente complessato mescolando insieme in un rapporto molare di 1:1 per una concentrazione finale soluzione di 2,625 micron Lipofectamine e 2,625 micron substrato. Poi, le cellule sono state fatte coincidere con il 2.625 μM Lipofectamine-Cy5-I-plasmide o Lipofectamine-Cy5-shRNA in mezzo senza siero per 4 h, rispettivamente. Nel caso del controllo solo cellulare, le cellule sono state fatte coincidere con DMEM senza siero contenente 1% (v/v) di penicillina (HyClone). Dopo 4 h di coincubazione, tutti i campioni sono stati lavati due volte con tampone fosfato-bufferato (PBS) (0,1 M, pH 7,4) e le cellule sono state ulteriormente incubate per 6 h in un terreno di crescita contenente 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS; HyClone) e 1% di penicillina per garantire un sufficiente recupero cellulare e tempo di assorbimento. Le cellule coltivate sono state fissate con formaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente e ulteriormente lavate tre volte con tampone PBS (0,1 M, pH 7,4). Per l’imaging al microscopio, i coprioggetti con le cellule attaccate sono stati montati su vetrini di vetro usando un mezzo di montaggio acquoso con un agente antifading. Le immagini di fluorescenza sono state registrate utilizzando un microscopio Zeiss Axioplan 2, e le immagini sono state scattate utilizzando una fotocamera Zeiss Axiocam HR.

Esperimento di silenziamento del gene GFP utilizzando l’I-gel

Prima, l’I-gel contenente 262,5 µM X-DNA e 175 nM I-plasmide è stato incubato con 300 U di T7 RNA polimerasi (Thermo Fisher Scientific) per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, il campione di I-gel è stato diluito fino a 100 volte in DMEM senza siero contenente 1% di penicillina. Poi, 1/6 volte il volume di I-gel / polimerasi complesso è stato aggiunto a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con coprioggetto che era stato preplaccato con cellule MDCK-GFP (20.000 cellule per pozzetto) per 24 ore. Per l’I-plasmide, miscela di plasmidi scrambled, e scrambled gel plasmide set, MDCK-GFP cellule sono state co-coltivate con la stessa quantità molare di ciascun plasmide e T7 RNA polimerasi come nel caso della I-gel. Per misurare l’effetto RNAi di shRNA nudo e Lipofectamine-shRNA, 100 volte di più di ogni campione di RNA è stato utilizzato rispetto al numero di template I-plasmide, prendendo in considerazione il tasso di espressione shRNA del I-gel come calcolato dall’esperimento lisato cellulare. Per i set shRNA nudo e shRNA scrambled, le cellule MDCK-GFP sono state fatte coincidere con 175 nM del campione di RNA. I campioni Lipofectamine-complexed sono stati preparati secondo le istruzioni del produttore. Per il Lipofectamine-I-plasmide e Lipofectamine-scrambled set miscela plasmidica, Lipofectamine e ogni campione plasmidico sono stati elettrostaticamente complessato mescolando insieme in un rapporto molare di 5:1 per ottenere una concentrazione finale soluzione di 8,75 nM Lipofectamine e 1,75 nM substrato plasmidico. Per il set Lipofectamine-shRNA, Lipofectamine e shRNA libero sono stati complessati elettrostaticamente mescolandoli in un rapporto molare di 5:1 per ottenere una concentrazione finale della soluzione di 875 nM Lipofectamine e 175 nM shRNA. Le cellule MDCK-GFP sono state fatte coincidere con i campioni lipofectamina-complessi preparati in mezzo privo di siero per 4 ore. Per il set di sole cellule, solo le cellule MDCK-GFP sono state incubate nel mezzo privo di siero per 4 ore, senza alcun campione. Tutti i campioni sono stati lavati dopo il periodo di coincubazione 4 h, e le cellule sono state inoltre incubate per 48 h con il mezzo di crescita (DMEM contenente 10% (v/s) FBS e 1% penicillina) per valutare l’effetto RNA-silenziamento a 37 ° C sotto il 5% di CO2. Le cellule sono state poi fissate con formaldeide al 4% per 10 min a temperatura ambiente e lavate con tampone PBS (0,1 M, pH 7,4). Per l’imaging al microscopio, le cellule attaccate al coprioggetto sono state montate su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso con un agente antifading.

Analisi dell’espressione genica mediante PCR quantitativa in cellule vive

Tutti i campioni sono stati trattati e incubati in ogni mezzo cellulare nella stessa quantità e nella stessa condizione utilizzata nell’esperimento di silenziamento genico GFP precedentemente descritto utilizzando la sezione I-gel. Dopo l’incubazione, il mezzo cellulare è stato aspirato dalle piastre di coltura cellulare, e le cellule MDCK-GFP sono stati lavati una volta con tampone PBS e tripsinizzato per staccare le cellule in ogni pozzo della piastra. Le cellule staccate sono state diluite con tampone PBS per disattivare la tripsina, e sono state poi raccolte in una microprovetta da 1,5 mL e pellettizzate per centrifugazione (180 g, 5 min). Il surnatante è stato rimosso e le cellule sono state diluite con 20 µL di tampone PBS. La soluzione di sospensione cellulare (20 µL) è stata trattata con 1 mL di reagente TRIzol, 3 µL di cel-miR-39 (33 fmol/µL) e 200 µL di soluzione di cloroformio. La successiva estrazione dell’RNA è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore. Per quantificare la quantità relativa di GFP mRNA e shRNA a livello cellulare, tutte le qPCR delle preparazioni del campione sono state effettuate con lo stesso metodo descritto nelle sezioni “Preparazione dell’RNA totale e trascrizione inversa” e “PCR in tempo reale e analisi dei dati”.

Analisi delle immagini delle cellule per la quantificazione dell’intensità dei pixel

Per l’elaborazione dell’immagine cellulare, i dati sono stati condotti utilizzando il programma MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). Le immagini grezze di fluorescenza sono state importate in MATLAB, e ogni pixel nelle immagini è stato convertito in ogni componente della matrice. La distribuzione delle intensità di fluorescenza di ogni componente è stata rappresentata graficamente da un istogramma. L’intero set di dati è stato diviso in 256 intervalli.

Analisi di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

Le cellule sono state lavate una volta con 1 mL di PBS seguito dall’aspirazione del mezzo di crescita dalle piastre di coltura cellulare. Poi, le cellule sono state staccate dalla piastra mediante trattamento con tripsina. Le cellule staccate sono state raccolte in una provetta da 15 mL seguita da centrifugazione con conseguente pellet (180 g, 3 min). Il surnatante della soluzione di tripsina è stato rimosso e il pellet di cellule è stato lavato due volte usando 2 mL di PBS. Le cellule sono state risospese in PBS ad una concentrazione di 50.000 cellule/mL. Poi, i campioni sono stati preparati fissando le cellule in una soluzione di formaldeide all’1% per 10 minuti a temperatura ambiente. I campioni sono stati analizzati per l’intensità di fluorescenza GFP usando il sistema FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Livelli di vitalità relativa in condizione di buio

Una sospensione cellulare MDCK-GFP (5000 cellule per pozzetto) è stata dispensata in una piastra a 96 pozzetti (Corning Inc., Corning, NY, USA) e incubata per 1 giorno a 37 °C sotto 5% CO2. Una volta che le cellule si sono attaccate alla piastra, sono state fatte coincidere con diverse concentrazioni di I-gel (corrispondenti alla concentrazione di X-DNA) nel mezzo di crescita (DMEM contenente 10% (v/v) FBS e 1% penicillina) al buio. L’I-gel era composto da un rapporto molare X-DNA:I-plasmide di 1500:1. Questi campioni sono stati incubati per 6, 24 e 48 ore a 37 °C sotto il 5% di CO2. Alla fine di ogni tempo di incubazione, la soluzione Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Giappone) è stata aggiunta ai campioni secondo le istruzioni del produttore. Dopo un’ulteriore incubazione di 1 ora, l’assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre. I risultati di questa misurazione sono stati espressi come il rapporto tra l’assorbanza del campione e quella delle cellule di controllo negativo senza incubazione del campione.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita con il software Prism 7.05 (GraphPad Software) per il test t di Student, ANOVA a una via con post test di Bonferroni per confronti multipli. Il post test di confronto multiplo di Holm-Bonferroni è stato eseguito utilizzando i risultati del post test di confronto multiplo di Bonferroni dal software Prism 7.05 (GraphPad Software)30. Il test di normalità è stato calcolato mediante il test di Shapiro-Wilk. Nei risultati del test di Shapiro-Wilk, i dati erano approssimativamente distribuiti normalmente. La significatività statistica è indicata come *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.