タンパク質の研究に関連するすべての実験では、正確なタンパク質定量が不可欠であるため、あるアッセイにおけるタンパク質の濃度を測定するさまざまな方法が開発されました。 全タンパク質定量のより伝統的な方法には、280nmにおけるUV吸光度の測定（A280）、ビシンコニン酸（BCA）およびブラッドフォードアッセイ、ならびにローリーおよび他の新規アッセイなどの他の代替方法がある。
タンパク質が特定の波長で光を吸収するので、測定は分光光度計を用いて得ることが可能である。 特に、アミノ酸のチロシンとトリプトファンは280 nmに非常に特異的な吸収を持つため、タンパク質濃度をA280で直接測定することができます。
280 nmでの紫外線吸光度は、その単純さ、使いやすさ、手頃さから、実験室でタンパク質濃度の推定に日常的に使用されています。 インキュベーションの必要がないため、測定は短時間で済み、再現性も高い。
ただし、タンパク質試料に同じ吸収スペクトルを持つ非タンパク質成分（核酸など）が含まれていると、誤った結果を招くことがあるため、注意が必要である。 吸光度値は、タンパク質濃度の測定以外にも、立体構造変化やリガンド結合の検出、酵素反応の追跡などに利用することができる。 これらの残基はそれぞれ明確な吸収波長と発光波長を持ち、量子収率にも差がある。 フェニルアラニンやジスルフィド結合もこの波長の吸収に寄与するが、比較的重要ではないため、トリプトファンとチロシンの両方がない場合にのみ観察できる。
芳香環構造を含む多くの酵素補因子（例えば、FMN、FAD、NAD、ポルフィリン）も励起用の紫外線を吸収し、結果として蛍光の強さを増すことになる。 緑色蛍光タンパク質のような特殊なタンパク質は、翻訳後に修飾された内部のセリネチロシン-グリシン配列を持ち、可視光領域で蛍光を発する。
トリプトファン
チロシンやフェニルアラニンよりもかなり蛍光性が強い。 しかし、その蛍光特性は溶媒依存的であり、すなわち、溶媒の極性が低下するとスペクトルは短波長にシフトし、強度が増加する。 そのため、折りたたみタンパク質の疎水性ドメインに埋もれたトリプトファン残基は、10〜20nmのスペクトルシフトを示す。
その大きな吸収性、高い量子収率、共鳴エネルギー移動により、3つのアミノ酸を含むタンパク質の蛍光スペクトルは通常トリプトファンのものと類似している。
チロシン
チロシンはトリプトファンと同様の波長で励起されることがありますが、明らかに異なる波長で発光することになります。 チロシンはトリプトファンに比べて蛍光が弱いのは事実かもしれないが、多くのタンパク質に大量に存在するため、重要なシグナルとなり得る。 チロシンの蛍光は、近くにトリプトファン部位があると、共鳴エネルギー移動または芳香族水酸基のイオン化によって消光することが観察されています
ここで、A280法を用いてペプチドを測定する際のいくつかの重要なポイントを紹介します。
- 同じ分子量のタンパク質でも、トリプトファンやチロシンの含有量の違いにより吸光度が異なることがあります。
- また、紫外線の吸光度はタンパク質の構造の影響を受けます。 したがって、構造に影響を与える条件（温度、pH、イオン強度、または洗剤の存在など）は、芳香族残基が280 nmで光を吸収する能力に影響を与え、タンパク質の消衰係数の値を変えることができる。
- 芳香族アミノ酸の局所環境は、そのスペクトルに影響を与えることがある。 つまり、トリプトファンはタンパク質の疎水性内部領域に埋もれると低い波長に発光ピークを持つようになり、一方チロシンは隣接するトリプトファンアミノ酸にエネルギーを移すことが多い。 pHの上昇によってチロシンからプロトンが失われたときにできるイオン化チロシン酸は、トリプトファンと同様の波長を示す。