アセチルコリンはアセチルコエンザイムAとコリンからコリンアセチルトランスフェラーゼという酵素により合成される。 神経系では、この酵素は主に神経末端の細胞質に存在すると考えられている。 コエンザイムAはミトコンドリアで合成され、ミトコンドリア膜を通過して細胞質へ運ばれた後、コリンアセチルトランスフェラーゼにアクセスします。 アセチルコリン産生に用いられるコリンは、肝臓での合成のほか、食物からも摂取される。 毛細血管内皮細胞には、遊離型およびリン脂質型のコリンを脳へ輸送するキャリアシステムが存在する。 コリンを含むリン脂質が加水分解されると、アセチルコリン合成に使用されるコリンが遊離することもある。 コリンアセチルトランスフェラーゼは神経末端に存在すると推定されるアセチルコエンザイムAとコリンの濃度では飽和しないため、アセチルコリン合成の速度は前駆体の利用可能性に依存すると思われる。 酵素活性は生成物の阻害によっても制御されている。コリンアセチルトランスフェラーゼのアロステリックサイトに結合することで、アセチルコリンはその活性を阻害するのである。 さらに、質量作用と神経細胞の活性がアセチルコリンの生成速度に影響を与える。 酵素活性の短期的な調節は、プロテインキナーゼによって誘導されるリン酸化によって部分的に達成される。 アセチルコリンのライフサイクルにおけるこの段階の薬理学的阻害（例えば、ナフチルビニルピリジンによる）は、コリン輸送の阻害よりも伝達物質に対する影響が小さいことに留意すべきである。 コリンアセチルトランスフェラーゼと小胞アセチルコリントランスポーターの遺伝子は、単一の遺伝子座に組織化されており、2つの遺伝子の転写は通常、共制御されています。 (±)-ベサミコールはこのトランスポーターの選択的阻害剤であり、L-(-)-ベサミコールはD-(+)-ベサミコールより強力である。 アセチルコリンは小胞にパッケージされた後、エキソサイトーシスにより刺激に応じた放出が行われます。
神経細胞のアセチルコリンエステラーゼは、脳内で放出されたアセチルコリンの大部分を速やかに不活性化するが、グリア細胞に含まれるブチリルコリンエステラーゼはシナプス内のアセチルコリンのごく一部を加水分解すると考えられている。 末梢では、アセチルコリンエステラーゼはコリン作動性神経支配を受けている筋肉に存在し、ブチリルコリンエステラーゼはより広く分布している。 アセチルコリンエステラーゼの可逆的阻害剤（フィソスチグミン、BW284C51など）および不可逆的阻害剤（イソOPAなど）が多数知られており、これらの薬剤はアセチルコリンのシナプス作用を延長させる作用がある。 アルツハイマー病の治療薬として、ドネペジル、リバスチグミン（ENA 713）、エプタスティグミン、ガランタミン（galanthamine）などの第二世代可逆性抗コリンエステラーゼが採用されています。 第二世代コリンエステラーゼの中には、許容できない副作用のために臨床使用を中止されたものもあります（例：タクリン、メトリフォネート）。 非可逆的なアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は殺虫剤や化学兵器として使用されている。 アセチルコリンエステラーゼによってアセチルコリンから遊離されたコリンは、高親和性トランスポーターによってコリン作動性ターミナルに再び取り込まれ、伝達物質の合成に再利用されます。 Hemicholinium-3は、コリンの輸送を強力かつ可逆的に阻害し、その結果、アセチルコリンの生成を著しく低下させます。 A-4（HC-3のビス4-メチルピペリジンアナログ）は、Hemicholinium-3とは異なり、末梢投与により活性化されます。 コリンのナイトロジェンマスタード類似体は、高親和性コリンの取り込みを強力に阻害する不可逆的な阻害剤である
。