要旨
背景 ATP-binding cassette, subfamily D, member 1(ABCD1)タンパク質は、超長鎖脂肪酸(VLCFA)の分解を可能にするペルオキシソームのハーフトランスポーターである。 ABCD1の病原性変異体は、様々な組織や体液にVLCFAを蓄積させ、X連鎖性adrenoleukodystrophy(X-ALD)と呼ばれる疾患を引き起こす。 この疾患は、副腎皮質機能不全と高いVLCFA濃度を示すことが最も一般的で、表現型によって神経学的な病変の程度が異なる。 例えば、Addison only型のX-ALDでは神経への影響はないが、cerebral型のX-ALDでは重度の感覚障害、運動機能障害、認知機能低下、死亡を引き起こすことが多い。 方法 新たにABCD1の病因と疑われる変異体を、当社のプロテイン・インフォマティクス・プラットフォーム(PIP)を用いて解析した。 遺伝子検査データをもとに、解析と臨床研究を補完する形で、パーソナライズされたタンパク質レベルの分子研究を完成させた。 結果 成人発症のadrenomyeloneuropathy(AMN)の1例と新規のABCD1バリアントを紹介する。 ユニークなABCD1タンパク質について考察し、プロバンドの症例を既存のAMNの報告と比較した。 結論 複数のソースからのデータフュージョンは、患者の疾患と予後を豊かに評価する包括的なアプローチで結合された。 臨床的意義と病原性を確認するために分子モデリングが行われた。 はじめに
ATP-binding cassette, subfamily D, member 1(ABCD1)タンパク質は、脂質、代謝物、その他の分子を細胞間または細胞内構造物と受け渡す役割を果たす膜貫通タンパク質からなるATP-binding cassette transporterスーパーファミリーの一部である。 Xq28に位置する遺伝子ABCD1によってコードされている。 ABCD1 はペルオキシソームのハーフトランスポーターであり、ATP と結合して超長鎖脂肪酸 (VLCFA) をペルオキシソーム内に取り込みます。 ABCD1が機能不全に陥ると、VLCFAをペルオキシソームに移動させて分解することができなくなり、体液や組織中にVLCFAが蓄積される。 このVLCFAの異常蓄積は、最も一般的なペルオキシソーム障害であるX連鎖性adrenoleukodystrophy(X-ALD)の特徴的なバイオマーカーとして機能している。 X-ALD は、主に脱髄、神経変性、副腎皮質機能不全を伴う遺伝的疾患である。 ABCD1遺伝子には800以上の変異体が報告されている。 それにもかかわらず、明確な遺伝子型と表現型の相関は観察されていない。
ヘミ接合体の男性は通常、最も重大な症状を示すが、ヘテロ接合体の女性は人生の後半に障害の程度が軽くなることが多い … 続きを読む 3つの典型的な表現型は、アジソン病のみ、副腎皮質脊髄症(AMN)、脳性ALDである。 アジソン病のみの患者は、通常2歳から7歳の間に副腎皮質機能不全を呈します。 神経変性は初期には見られませんが、年齢とともに進行することが多いです。 AMNは通常、人生の3〜4年目に発症し、主に脊髄を侵す。 臨床的特徴は、しばしば進行性の脚のこわばりや脱力感である。 副腎機能不全はAMN患者の約2/3に認められ、大脳の変化はその約半数に認められます。 大脳 ALD は最も重篤な表現型であり、大脳の脱髄により聴覚、視力、運動機能、認知機能が急速に低下する。 7221>
本報では,30代でAMNと診断されたプロバンドの病歴を詳細に報告する. ABCD1遺伝子の分子生物学的解析の結果、この症例では意義不明の変異が同定された。 興味深いことに,この変異体はALD Mutation Databaseで病原性が報告されているが,臨床例に関する情報は公表されていない。 このプロバンドの臨床例は、このABCD1変異の病原性をよりよく支持するために含まれている。 また、PIP(Protein Informatics Platform)を用いて包括的な分子モデリングを行い、この変異体の重要性をさらに明らかにし、プロバンドの診断につなげた。 ケーススタディ(臨床的説明)
プロバンドは31歳の男性で、進行性の神経学的状態の評価のために受診した。 症状は2年前に発症し,頻繁につまずくようになった. その後,全身の筋力低下とこわばりが出現し,さらに歩行障害も出現した。 このため、過去7ヶ月間、歩行補助のためにローリングウォーカーを使用していた。 また、尿失禁も発症していた。 さらに、脳霧、記憶喪失、注意欠陥、不安、疲労を訴えた。 その結果、基本的な精神的タスクに時間がかかるようになった。 また、アルコールがこれらの障害を悪化させたという。 最後に、この患者は、発症以来、体重が20ポンド減少し、懸命な努力にもかかわらず、体重を回復することができなかった。 この体重減少は、部分的には、朝に最もよく見られた吐き気と嘔吐の症状によるものであった。
身体検査では、probandは、手を使わないと座位から立ち上がることができない状態であった。 軽度の失調性構音障害が確認された。 視標検査では,矩形波状のピクピクした動きがまれに認められた. 滑空追従はサッカードで,垂直,水平ともにゆっくりとした完全なサッカードを示した. 上肢の伸展反射は病的なまでに鋭敏であった. また,下肢の伸張反射は病的なほど活発で,足首の持続的なクローヌスを含んでいた. 拇趾の固有感覚は中等度に障害されていた. 下肢では軽度の上部運動ニューロン分布の弱化がみられ,腸腰筋は温存されていた. 踵-脛骨間テストでは相乗効果がみられた. また,歩行時には足元を見るようになり,歩幅が小さくなっていた. 膝は過伸展し,つま先立ちで歩くことが多く,時折足を滑らせることがあった. ロンベルグ徴候がみられた. 立位では,大腿四頭筋を中心とした脚の震えが見られた. 3回の試行で360度回転し,1回の回転に9〜15歩を要した. 脳MRIは正常,頸椎MRIは軽度のびまん性脊髄萎縮を示唆する所見であった. 亜急性複合変性症や他の後天性脊髄疾患の所見は認められなかった(図1)。 ライムIgM力価が陽性であったため、ライム病の治療を受けていたが、有意な改善は記録されていなかった。 脳脊髄液はacellularと記載されていた。 HIV,HTLV1,C型肝炎,B型肝炎,サイトメガロウイルスの検査は陰性であった. 家族歴は,本人の病歴に関する知識が乏しいため,同様の症状を示す家族歴は確認できなかった(図2)
これまでの検査と画像診断の結果、probandのペルオキシソーム脂肪酸プロファイルが得られている。 C26 : 0, C24/C22, C26/C22の濃度に異常が認められ,X連鎖性副腎皮質脊髄症の半接合性が示唆された. 副腎皮質刺激ホルモンが528 pg/mL(RR:7.2-63)測定された。 その後、ABCD1遺伝子の塩基配列決定と欠失・重複解析が行われた。 プロブジェクトは、ABCD1における意義不明の変異体、c.1599G>T (p.Lys533Asn) のヘミ接合体であった。 この変異体はALD Mutation Databaseでは病因とされているが、ExACオンラインデータベースには存在しなかった。 c.1596A>G (p.Lys533Glu) と c.1598A>G (p.Lys533Arg) という二つの類似した変異も臨床的に重要であると以前に報告されている
3. 方法
3.1. 構造モデリング
ヒトATP-binding cassette subfamily D member 1(通称ABCD1)の配列は、トランスポータータンパク質と思われ、ATP結合領域を持ちATPase活性を持つサブユニットとして作用できるフォールドを持っている。 活性型トランスポーターを形成するためには、正しい二量体化が必要であることが知られている。 ABCD1はALDサブファミリーの一員であり、ペルオキシソームの脂肪酸の細胞内への輸入に関与している。 これらのペルオキシソームABCトランスポーターは「ハーフトランスポーター」と呼ばれ、パートナーのハーフトランスポーター分子を必要とし、機能形態は常にホモ二量体またはヘテロ二量体である。 ABCD1は、超長鎖脂肪酸のペルオキシソームでの輸送や異化の鍵であると推測される。 ABCD1はPEX19と相互作用することが知られており、NCBI Reference Accession Sequenceから取得したABCD1遺伝子によってコードされている。 NP_000024: version NP_000024.2というアミノ酸配列にコードされており;コンピュータ支援モデリングに使用された。 7221>
モンテカルロ法用のX線精密化はYASARA SSP/PSSM Methodを使用して構築された。 この構造は、YASARAの知識ベースポテンシャルを用いてYASARA/Amber力場に緩和された。 側鎖とロータマーは、知識ベースポテンシャル、溶媒を明示したシミュレーションアニーリング、YASARAの精密化プロトコルを用いた小さな平衡シミュレーションで調整された . 7221>
完成したモデルの精密化は、 SchrodingerのLC-MODモンテカルロベースのモジュールまたはNAMD2プロトコルを使用して完了しました。 これらの洗練は、YASARAが生成した初期洗練とバリアントで開始されました。 重複する領域の重ね合わせとその後の精密化により、ABCD1 の完全なモデルが得られました。 最終的な構造はPR conjugate gradientとR依存の誘電体でエネルギー最適化を行った。
全長の野生型モデル(WT)の全745アミノ酸(12201原子)および変異型の745アミノ酸(12221原子)について、鎖名、二面体、角度、ねじれ、非結合、静電、原子タイプ、パラメータが正しいことを確認するために、原子整合性のチェックを行った。 二量体モデルは、補因子とイオンを含む24,402原子から構成されていることが予測されます。 各モデルは以下のフォーマットでエクスポートされた。 Maestro (MAE)、YASARA (PDB)。 モデルの操作は Maestro (Macromodel, version 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010) または Visual Molecular Dynamics (VMD) で行いました. 解析は、長さと変異部位からのC末端距離を考慮して、最初の350アミノ酸を含むN末端領域に重点を置きました。
Monte Carlo dynamics searching (hybrid MC or via enhance MDS sampling) は、文献に記載されている方法を使用して、コンフォーメーションのサンプリングのために各モデルで行われました。 簡単に言うと、各ABCD1変種系は、Steepest DescentまたはConjugate Gradient PRのいずれかを使用して、緩和された拘束で最小化し、文献に示されているように、MC検索基準を通過するようにしました … このシナリオでは、MCの主な目的は、変異に近い領域で異なる変異で発生する可能性のあるコンフォメーション変動と、ABCD1とのDNA結合または処理への影響の可能性を調べることである。 結果
4.1. 構造機能研究
WTと変異型p.K533Eについて、アミノ酸あたりΔGのエネルギー計算によるオブジェクトの安定性は比較的変わらず、WTのオブジェクト安定性は114.67 kcal/mol∗Å2 であることが判明した。 p.K533Eの変異体では、自由エネルギーが2.321 kcal/aa∗mol∗Å2 増加し、局所領域が不安定になる可能性がある。 この物体の安定性は、分子シミュレーションによるコンフォメーションサンプリングによって、何らかの動的な変化が起こる可能性があることを示す正の値であった。 そこで、我々は局所的な残基を調べ、静電計算が機能の変化を説明するのに有効であると判断した。 図3(a)に、これまで確立してきた最新の方法を用いて、完全構造とその変異型の分子モデルを示します。 二量体モデルは機能にとって重要であり、変異体変異によって破壊された変異部位での重要な相互作用を示す。
変異部位(p.K533E)付近の12 Åカットオフ以内の局所残基には両方のモノマーからの残基が含まれる。 変異体を含むモノマー(モノマー1、灰色の炭素)は、533位-相互作用のある以下の近傍の残基を有する。 E471、Q472、I474、I475、E499、Y532、P534、P535、およびK624(図3(b))。 この変異体構造(p.Lys533Glu)を解析したところ、正のリジン(+)の電荷が負のグルタミン酸(-)に反転することから、局所環境のより直接的な崩壊が示され、それは隣接する荷電残基をかなり破壊していた(上図)。 特に、残基K624、E499、Y532は異なる相互作用に置かれる(図3(b))。 アミノ酸あたりの局所的なΔGは、ポケット内の不利な安定性に対応する正味の正の値を増加させ、より長いダイナミクスは、全体的な効果を決定するために必要となるが、不安定化すると予想されることができる。 K533E残基はQ472, I474, I475, E499と興味深い相互作用を持っている。 K533Eはヘリックス-ヘリックス領域にあり、その荷電側鎖は反対荷電種に対して外側に位置している。また、隣接ヘリックスとのヘリックス-ヘリックス相互作用もある(図3(b)および図3(c))。 同じ残基が変異体にも関与しているが、P534、P535、K624を含むいくつかの残基では位置が変更されている(図3(c))。 この相互作用により、局所的な構造安定性のための動的挙動が変化し、機能が変化したと考えられる(図3(c))。 さらなる解析のために、静電計算が完了しました(図4)。 特に、K624、E499、およびY532残基は異なる相互作用に配置されている(図3(b))。 アミノ酸ごとの局所的なΔGは、ポケット内の不利な安定性に対応する正味の正の値を増加させ、全体的な効果を決定するためにはより長いダイナミクスが必要となるが、不安定化すると予想することができる。
図4
静電容量のマッピングは、745アミノ酸構造全体に対する溶媒和のポアソン-ボルツマン計算を使用して達成された。 変更の影響は、両者とも+3 KT/Eカットオフで静電分布に強く顕著に現れた。 WT粒子(全745 aa)では、K533の周辺に明瞭な電荷分布が見られ、負電荷領域は少なく、上記のヘリックスに見られる豊富な疎水性残基による大きな中性ポケットが見られる。 スレオニン変異は、電荷に対する分布を変え、中性荷電領域のサイズを大きくする一方で、負電荷の位置を互いに遠ざけるようである(図4(a)および図4(b))。 p.K533Eの局所領域は、正のリジン残基と隣接するグルタミン酸残基(6Å以内)を一致させるように帯電している(図4(b))。 逆に、残基K533は、6Å以内の残基、すなわちE471、Q472、I474、I475、E499、Y532、P534、P535、K624によって影響を受ける正の電荷を持っている(図4(a)). 変異体p.K533Eは単量体間の界面から遠位にあるため、二量体自体には影響を及ぼさないようである(図3および図4)。 しかし、リジンは本来、反対電荷を持つ近傍の残基とポケットに挿入され、H-結合や塩橋相互作用をしているが、グルタミン酸置換による負電荷で失われた局所近傍では大きな混乱が見られる(図3)。 考察
AMNの患者にとって、治療の選択肢は現在限られている。 しかし、最近のマウスモデルを用いた研究により、解決の糸口が見えてきた。 X-ALD患者では、VLCFAの蓄積は、ラジカル酸素種のレベルの増加を伴う。 これらのラジカルは病気の進行を促し、組織を傷つけ、最終的に神経症状を出現させる。 X-ALDのマウスに抗酸化物質の混合物を投与したところ、ラジカルレベルをコントロールすることに成功し、この病気の進行を止めることができました。 この後の臨床試験が有望であることが証明され続ければ、私たちの患者や他のAMN患者もいつか同様の方法で治療される可能性があります。
私たちの患者はABCD1の理解されていない変異体を呈していましたが、彼の場合は典型的なAMN表現型と大きな違いはありませんでした。 症状は20代後半に始まり,予想される20〜40歳の年齢層と合致している。 AMNは一般に脊髄に病変を持つが、この患者のMRIでもそれは確認された。 脚力低下と歩行異常はこの病気の特徴であり、尿失禁も同様である。 嘔吐と吐き気は副腎機能不全と関連し、言語と精神の異常は大脳の変化と関連している可能性がある。 しかし、今回の患者と同じABCD1変異体を持つ患者でも、異なる症状を示す可能性があると言わざるを得ない。 ABCD1の病原性バリアントは、たとえ家族で同じバリアントを持っていても、予測可能な表現型になることはほとんどありません。
バリアントと野生型の分子モデリングに統計力学計算を適用して得られたタンパク質情報学から、機能に影響を与える分子レベルでの正常なタンパク質挙動を阻害することが明確に示されました。 例えば、変異体p.K533Eでは、自由エネルギーが2.321 kcal/aamolÅ2増加し、K533残基から12Å以内の局所領域が不安定化することが分かった。 この局所的な構造変化は、バックボーン残基と二次構造の相互作用の変化(H-bond network not shown)によって緩和されたため、相関した動きが構造全体に伝播し、二量体の適切な形成がさらに阻害されることになった。 さらに、物流上の問題やプロバンドの家族数が少ないことから、家族分離解析は現実的ではありませんでした。 その結果、彼の変異型の重要性をよりよく理解するために、このプロセスを完了させることができませんでした。 ありがたいことに、分子モデリングが別の機会を与えてくれました。 タンパク質の分子モデリングは、 この変異型が臨床的に重要な形でタンパク質の機能に影響を与えるのではないかという疑いを裏付けてくれました。 この変異は、PIP分析によって強く支持された構造への重大な変化を考えると、病原性に分類されなかったであろうという疑いはなかった。 結論
結論として、我々はABCD1のまれな変異、c.1599G>T (p.Lys533Asn) を持つプロバンドを報告した。 この変異体に関する情報が不足していたため,遺伝子検査会社は彼の変異体を病原体と分類することができなかったが,分子電荷はタンパク質のこの領域が平衡から大きく擾乱されていることを示しているようである(図3(b))。 また、タンパク質のモデリングを行うことで、このプロバンドの臨床像に組み込むための情報を得ることができました。 さらに、この変異型の病原性はALD Mutation Databaseに1例掲載されている。 これらの証拠により、AMNと確信をもって診断することができた。 このプロブジェクトはAMNの典型的な症状を持っていたが、ABCD1固有の表現型の多様性により、この変異体を持つ他の個人は異なるX-ALDのプレゼンテーションを行うことができる。
略語
ABCD1: | ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (gene) |
VLCFA.ALCD1:ABCD1:ATP-binding-cassette(遺伝子)の略語。 | 超長鎖脂肪酸 |
X-ALD: | X-linked adrenoleukodystrophy |
AMN: | Adrenomyeloneuropathy. |
Data Availability
データセットおよび材料は原稿に詳述。
Consent
行ったすべての手順は、ヒト実験に関する担当委員会の倫理基準(機関および国)と2000年に改訂された1975年のHelsinki宣言(5)に従っている。 7221>
利益相反
すべての著者は、利益相反がないことを宣言する。
著者の貢献
上記のすべての著者は、研究の構想または設計、または研究のためのデータの取得、分析、解釈、および研究のドラフト作成または重要な知的同意のための重要な改訂に実質的に貢献し、出版されるバージョンの最終承認を与え、研究のいかなる部分の正確性または完全性に関する疑問も適切に調査および解決するために、研究のあらゆる側面に説明責任を持つことに同意した。
資金
この研究を完了するために資金を提供したメイヨー・クリニック個別化医療センターより資金提供を受けた。
謝辞
研究支援を受けたメイヨー・クリニック・ジャクソンビルの個別化医療センターに謝意を表す。