トランス-Hyp生産組換え株の構築
データベースにはL-プロリン4-ヒドロキシラーゼ遺伝子として推測されるものがいくつか存在する。 Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp.の遺伝子を含む。, Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 and Dactylosporangium sp. PCRを用いて、P. stutzerとB. bronchiseptica RB50からP4Hの推定遺伝子（p4hPとp4hB）をクローニングし、取得した。 これらは消化後対応するプラスミドにライゲーションされ、それぞれ C. glutamicum と E. coli に変換された。 p4hPの長さは918 bpsであり、p4hBの長さは924 bpsであった。 これらの配列はNCBIで報告されている遺伝子と100%同一であった。 Dactylosporangium sp.のtrans-P4H遺伝子（p4hD）は大腸菌で発現し、良好な酵素特性でL-プロリンを変換することに成功した。 p4hDの長さは816bpsで、分子量29,715ダルトンの272アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。 本研究では、p4hDを核酸塩基の一部を改変して応用した。 p4hDのオリジナル遺伝子配列（http://www.kazusa.or.jp/codon/）を解析した結果、C. glutamicumとE. coliの両方でいくつかのレアコドンが存在することが分かった。 希少コドンはタンパク質の低発現と強く関連していることが報告されている。 異種タンパク質発現のためのコドン最適化は、しばしば、タンパク質発現を劇的に増加させることが示されている。 そこで、p4hD遺伝子の希少コドンをC. glutamicumで高頻度に用いられているものに置換し、同義変換によりGC含量を73%から61%に調整し、C. glutamicumのGC含量に近づけることに成功しました。 以上の修正によりp4hDの修正遺伝子を合成した（Additional file 1）。
P4Hの発現はtrans-Hyp生合成経路を構築する上で重要な点の一つである。 図2は、リコンビナントC. glutamicumと大腸菌で発現させたtrans-P4HのSDS-PAGEを示したものである。 すべてのリコンビナントtrans-P4Hは、封入体を含まない可溶性タンパク質として発現していた。 大腸菌で発現させたtrans-P4Hは、C. glutamicumで発現させたものよりも明らかに多く発現していた(図2)。 外来タンパク質の発現には、プロモーター、宿主・ベクター系、培養条件など多くの因子が影響する。 図2
trans-P4Hの各菌株での発現結果。 A1：大腸菌BL21/pET28a-p4hD；A2：大腸菌BL21/pET28a-p4hP；A3：大腸菌BL21/pET28a-p4hB。 B1: C. glutamicum ATCC15940/pECXK99E-p4hD；B2: C. glutamicum ATCC21355/pECXK99E-p4hD; B3: C. glutamicum ATCC21157/pECXK99E-p4hD; B4: C. glutamicum 49-1/ pECXK99E- p4hD.
P4H活性の比較
オキシゲナーゼは、温和な条件で活性のないC-H結合を特異的に酸素化する触媒として、特に基質に分子酸素を移動させることができることから、産業界で広く応用されています。 P4Hは2-オキソ酸依存性ジオキシゲナーゼに属し、単量体タンパク質であり、高分子基質よりも単量体を利用する . 本研究では、リコンビナント全細胞を用いたtrans-P4Hの活性を測定した(Table 1)。 その結果、30℃において発現タンパク質量および酵素活性が高くなることが示された。 また、組換え大腸菌とC. glutamicumの発酵終了時のプラスミド安定性はいずれも98%以上であり、非常に安定であることが示された。
異なる遺伝子を発現させた組換え細胞はL-プロリンに対する触媒活性が異なるレベルを示していることが確認された。 大腸菌BL21/ pET28a-p4hDで発現させたtrans-P4Hの活性は構築した組換え株の中で最も高かった。 P. stutzeriとB. bronchisepticaから新たにクローニングされ発現した遺伝子も興味深い活性を示した。 宿主の違いでは、大腸菌がC. glutamicumよりも高い活性を示したが、これは対応するプラスミドの性能と関係があるものと思われる。 C. glutamicumの4つのL-proline生産株を発現宿主株として用い、得られた組換え株は異なる酵素活性を示した。 C. glutamicumの中で最も高い比酵素活性を示したのはC. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hBで40.7 U/mg – wet cellであった。 しかし、リコンビナントE. coli/pET28a -p4hDの比酵素活性は最大60.4 U/mg – wet cellであった。 3 種類の組換え大腸菌の増殖はほぼ同じであった。 しかし、C. glutamicumの菌株間には有意な差が認められた。 比酵素活性が高い組換えC. glutamicum株は比酵素活性が低い組換えC. glutamicum株に比べ、生育が遅かった。 また、大腸菌BL21 /pET28a -p4hDの酵素活性は、大腸菌W1485/pWFH1と同程度であり、大腸菌BL21/pET24-p4h1よりも高かった。 大腸菌W1485/pWFH1のp4hDはDactylosporangium sp. のオリジナルであるが、大腸菌BL21/pET24-p4h1のp4hDは改変したものであることが判明した。 本研究でのコドン最適化はC. glutamicum用に設計されたが、大腸菌でも成功したことが示された。
フラスコでのtrans-Hyp生産
異なる組み換えC. glutamicumと大腸菌によるtrans-Hyp生産も表1に示した。 これらの組換え菌株によるtrans-Hypの収率は、P4Hの酵素活性と細胞の増殖の両方に依存した。 大腸菌BL21/ pET28a-p4hDは最も高い収率を示したが、これはその特異的な酵素活性と一致した。 大腸菌は生産培地中で同様に増殖したが、trans-Hypの生産量には大きな差があり、特異的な酵素活性と同じレベルを維持することはできなかった。 また、C. glutamicum組換え株のtrans-Hyp生産量は、大腸菌BL21/pET28a-p4hDの生産量に比べ、非常に少量であった。 これは、C. glutamicumのtrans-P4Hの発現が少ないことと、細胞増殖が少ないことの両方によるものである。 また、4株のC. glutamicumのL-プロリン生産量は1g/L以下であった。 また、同じ遺伝子p4hDを持つC. glutamicumの組換え株では、一部の株が酵素性能やプロリン生産に優れていたものの、trans-Hyp生産にはほとんど差がなかった。
組換え株を用いて発酵によりグルコースからtrans-Hypを直接合成することは、プロセスに必要な酵素と前駆体が揃っているので実現可能であった。 過剰発現した外来型trans-P4HはL-プロリンのtrans-4位の水酸化反応を触媒し、2-ケトグルタル酸はグルコースからTCAサイクルで供給され、酸化的に脱炭酸されコハク酸になった（図1）。 p4h遺伝子を持つ組み換え大腸菌によるHypの生産には、プロリンが必要であることが報告されている。 発酵中に添加されたプロリンの炭素は、TCAサイクル中間体から合成されるアミノ酸にのみ流れ、糖新生には流れ込まない。 しかし、本研究では、プロリンを添加しなくても、蓄積されたHypは比較的高いレベルであった。 このことから、Corynebacteriumは強力なプロリン生合成経路を持つことが理解された。 また、大腸菌においてもプロリン生合成経路が同定されており、組換え大腸菌によるtrans-Hypの合成に寄与している可能性がある。 大腸菌のプロリン経路の改変はHypの収率を高め、一方、Hypの生成はプロリンのフィードバック阻害を緩和することができる . プロリン量（0-4 mM）はtrans-Hypの産生を促進した。 しかし、L-プロリンの連続添加は、生産収率を大きく向上させなかった（表2）。 本研究では、培養時間が文献で報告されている時間より大幅に短かったが、これは使用した培地の違いに起因すると考えられ、最適化により大きな可能性があることが示された。 実際、培地を少し変更したフラスコでは、L-プロリンを添加せずに2.28 g/L、4 mM L-プロリンを添加するだけで6.72 g/Lのトランス-Hypが組み換え大腸菌によって生産されている。
組み換えC. glutamicumと大腸菌によるtrans-Hypの生合成をさらに高めるには、別のアプローチも考える必要がある。 大腸菌では、プロリンの分解を克服することが必要である。 大腸菌のputA変異体によるtrans-Hyp生産はそれ以上向上しなかったが、利用したプロリンに基づく収量は大きく向上した。 C. glutamicumと大腸菌のいずれにおいても、リコンビナントP4Hをオキシゲナーゼの一つとして発現させることは、補酵素、共基質、酸素など宿主細胞の生理的代謝に関与している。 また、大腸菌の強力なプロリン合成経路がなければ、基質の入手や輸送の問題から、形質転換に重大な制約を受けることになる
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