構造概要
GAAは110kDaの糖タンパク質として合成される。 このペプチドはマンノース-6-リン酸受容体を介してライソゾームに標的化され、後期エンドソーム/ライソゾーム区画で一連のタンパク質分解とN-糖鎖プロセッシングを受け、4つの強固に結合したペプチドからなる成熟活性型が作られる19,20。 市販のMyozyme®前駆体rhGAA（Q57-C952）の結晶化では約7Å以上の回折を示す結晶が得られず、タンパク質障害予測因子21によりペプチドの障害領域の存在が示唆されたため、結晶接触形成の妨げとなる柔軟な表面ループの可能性を取り除くためにαキモトリプシンでin situプロテオリシスを実施しました。 このタンパク質分解処理により、rhGAA前駆体よりも約5kDa低い質量のポリペプチドが得られ（図2a）、容易に結晶化した。 このため、1.9 Åまでの回折データを収集し、分子置換法によってrhGAAの構造を決定することができた（表1）。 タンパク質分解消化体は前駆体と同等の活性（前駆体2.34 ± 0.06、成熟体2.26 ± 0.16 U mg-1）を示し、α-キモトリプシン処理によりrhGAAの機能性が変化していないことが示された。
Structure of mature rhGAA. a rhGAAのタンパク質分解処理 b GAA配列の模式図(*). ERTで使用するMyozyme® rhGAAはQ57残基から始まっている。 c trefoil type-Pドメイン（サーモン）、N末端βシートドメイン（スレート）、触媒GH31（β/α）8バレルドメイン（緑）、挿入I（ゴールド）と挿入II（ピンク）、近位（オレンジ）と遠位（ティール）βシートドメインからなるrhGAAの構造を漫画で表現している。 触媒残基（マゼンタ）および糖鎖（グレー）は棒で描かれている。 破線の円は、結晶化前にα-キモトリプシンによるタンパク質分解で除去されたペプチド部分を強調する。 (SPはシグナルペプチド、PPはプロペプチド）
rhGAAの結晶構造はヒト胎盤GAAおよびrhGAA20（図）の成熟型と対応している（表1、図2、図3）。 このことは、α-キモトリプシンで処理することにより、生体内で起こるタンパク質分解による成熟に匹敵する方法で、タンパク質分解に不安定な領域 (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 and A782-R794) を除去できることを示唆している。 rhGAAの全体的な構造は、ヒトのグリコシドヒドロラーゼファミリーGH311ホモログ、腸管ブラシボーダー酵素のマルターゼ-グルコアミラーゼ（MGAM）22，23およびスクラーゼ-イソマルターゼ（SI）24と似ている（図2cおよび補足図1）。 N末端のトレフォイルType-Pドメインに続いて、βシートドメイン、βストランドβ3（挿入物I）とβ4（挿入物II）の後に2つの挿入物を持つ触媒（β/α）8バレル、C末端の近位および遠位のβシートドメインが存在する。 rhGAAの前駆体は約14kDaの糖鎖を含み、7つのグリコシル化部位が予測され特徴づけられている20。 我々は、結晶構造中のそのうちの5つ、特にN140, N233, N390, N470, N652に様々な長さの糖鎖構造を観察した（図2cおよび補足図2）。
活性部位と阻害剤結合
rhGAAの狭い基質結合ポケットは触媒（β/α）8ドメインのβストランドのC末端付近にあり、N末端のβシートドメインからのループと挿入物IとIIによって形作られている（図2c）。 GH31ファミリーの酵素は、古典的なコシュランド型二重置換反応機構によって触媒反応を行い、生成物にはアノマーの炭素配置が保たれる。 GAA25の触媒部位の初期の特徴付けとファミリーGH3126,27の機構的に分離されたメンバーとの相同性から、触媒求核剤と酸/塩基はそれぞれD518とD616に割り当てることが可能である。 rhGAAと薬理学的シャペロンである1-deoxynojirimycin16,28およびその誘導体N-hydroxyethyl-deoxynojirimycin29（それぞれDNJおよびNHE-DNJ）の相互作用を知るために、rhGAAの結晶をこれらの活性部位指向性イミノ糖阻害剤に浸し、両方の複合体の回折データが得られた（2Å分解能）（表1）。 DNJは基質結合サブサイト-130に4C1コンフォメーションで結合し、D404, D518, R600, D616, H674の側鎖との水素結合により安定化されている。 さらに、W376, I441, W516, M519, W613, F649との疎水性接触により安定化された相互作用がある（図3a, b）。 W376の側鎖が20°傾く以外には、rhGAA活性部位にDNJが結合しても大きな構造変化は生じない。 NHE-DNJはDNJと同じポーズをとるが、ヒドロキシエチル置換基がM519とW481の側鎖に大きなコンフォメーション変化を引き起こす（図3c, d）。 このリガンドが誘導するコンフォメーションでは、インサートIの先端に位置するrhGAA残基W481はNHE-DNJのヒドロキシエチル置換基と安定化相互作用を確立している。 MGAMのN末端サブユニット（NtMGAM）31にNHE-DNJが結合すると同様の構造変化が観察される（補足図3a）
rhGAAへのリガンド結合。 図2cのように色分けされたrhGAAに結合したDNJ（a）、NHE-DNJ（c）、アカルボース（e）を、（a）と（c）の未結合rhGAA（グレー）に重ねたオレンジ色で表示した。 水素結合相互作用は破線で示した。 eでは基質結合部位に番号を付け、対称性に関連する分子の残基を白い棒で描いている。 リガンドをモデルに組み込む前に計算され、3.0mmで補正された非バイアスF o -F c差電子密度マップ。0 σで等高線表示した。
Substrate recognition and specificity
rhGAA による基質認識の認識を得るために、非開裂性α-1，4-四糖基質の類似体、アカルボースを浸したrhGAAの結晶について 2.45Å 分解能までの回折データを収集した（表1）。 この複合体では、サブサイト-1に留まるバリエナミン環は2H3の半座構造をとっているが、4C1の半座構造をとるDNJとのコンフォメーションの違いにもかかわらず、サブサイト-1での水素結合パターンは2つの化合物で本質的に同一である（Fig.） 加水分解できない「インターグリコシド」窒素は触媒中心を占め、触媒酸/塩基D616に水素結合している。 サブサイト＋1の6-デオキシグルコシル部分は、その2-および3-ヒドロキシル基を介して、保存されたR600およびN-末端β-シートドメインのループに由来するD282と水素結合を形成している。 配列的には保存されていないが、このループの残基は、GH31ファミリーのメンバーの利用可能な全ての結晶構造において、必ず糖鎖リガンドと相互作用している。 サブサイト＋2および＋3のアカルボースのマルトースユニットはrhGAAと直接相互作用せず、むしろ結晶格子パッキング相互作用と基質結合ポケットの縁に位置するW618の側鎖との水を介した接触によって安定化される。 しかし興味深いことに、rhGAAに結合したアカルボース・マルトース部位は、NtMGAM22に結合したときと同じポーズをとっており、rhGAAのサブサイト＋2および＋3にも機能的役割があると考えられる（補足図：NtMGAM22のサブサイト-1および＋1-2）。 1449>
グリコーゲンは、α-1,4結合のグルコース残基がα-1,6結合の枝を持つ直鎖によって構築された巨大な高分子である。 細胞質では、グリコーゲンホスホリラーゼと枝分かれ酵素が同時に作用し、エネルギー貯蔵粒子が分解される。 リソソーム内では、脱分岐酵素が存在しないため、GAAはα-1,4-およびα-1,6-グリコシド結合の両方の加水分解を保証する必要がある。 しかし、rhGAAはマルトースに対する特異性定数がイソマルトースに対する特異性定数の32倍であることから、明らかに前者の結合を好むことがわかる（補足表2）。 この二重基質特異性の構造基盤を明らかにするために、rhGAA結晶を加水分解しない4糖であるグルコピラノシル-α-（1,6）-チオマルトトリオースで浸漬することを試行した。 しかし、このアプローチは失敗に終わった。おそらく、結晶の接触がこの4糖の収容を妨げているためであり、α-1,6-結合によってアカルボースよりもわずかに長くなっているのである。 後者は基質結合クレフトにかろうじて入り、対称性のある分子と密接に接していることが観察されている（Fig.3e）。 我々は、rhGAAとBlautia obeum GAAの触媒ドメイン（β/α）8とイソマルトース32の複合体の構造重ね合わせにより、rhGAAの活性部位内に結合したα-1,6結合の2糖を導いた（Cα位置318個の配列に対してrmsd 1.50Å ）。 このモデルから、サブサイト-1とサブサイト＋1の間にα-1,6結合が存在しても立体障害は起こらず、サブサイト＋1のグリコピラノース部位とD282との間の水素結合が維持されていることが明らかになった（図4a、b）。 しかし、α-1,4結合よりもα-1,6結合の方が長いため、R600との安定化水素結合は弱く、α-1,6結合の枝に対する本酵素の活性が低いことが説明されるかもしれない。
rhGAA 基質認識・特異性とアロステリックシャペロン結合部位。 a イソマルトース（スチールブルー）のモデル、B. B. と重なることから得られたもの。 obeum α-グルコシダーゼとイソマルトースの複合体（PDB ID 3MKK）とのオーバーラップから得られたイソマルトース（スチールブルー）のモデルをrhGAA-アカルボース複合体に重ねたもの（Cα位置318点のrmsd 1.50Å） b 表面表現でrhGAAに結合したイソマルトースのモデル。 c アカルボシン（オレンジ）をモデルに取り込む前に計算され、2.0（水色）および3.0（青）σで輪郭を取った非バイアスF o -F c差電子密度マップによるrhGAAの二次基質結合部位。 d 完全に結合しているNAC1（橙）、部分的に結合しているNAC2（橙）。 dとeでは、NACをモデルに組み込む前に計算された非バイアスのF o -F c差電子密度マップが水色（2.0 σ）および青色（3.0 σ）で示されている。0 σ）
The secondary substrate-binding domain
rhGAA-acarbose complexでは、活性部位があるrhGAAの同じ面にあり、そこに結合したアカルボースから25Å離れたN末端のtrefoil Type-P domain内のポケット内に留まる第2のアカルボース分子のアカボシン部位も確認できた（Fig.4c）。 バリエナミン部分は、その4-および6-水酸基でC127の主鎖窒素および酸素、A93の主鎖酸素、D91の側鎖と水素結合している。 さらなる安定化相互作用はP125とW126とのスタッキング相互作用によってもたらされる。 P125とD91は、trefoil Type-Pドメインを構成するGH31ファミリーの酵素では保存されているか、保存的置換で置き換えられている（補足図4a）。 二次糖鎖結合部位に隣接する表面ループG116-M122はタンパク質分解処理により切り取られていた。 おそらく、GH31ファミリーのリソゾーム代表分子（補足図4a, b）に特有のセグメントG116-M122の除去が、二次基質結合ポケットの形成に寄与しているのだろうと思われる。 rhGAAの二次的なアカルボース結合部位は、本物の基質結合部位であり、酵素の処理能力を向上させる可能性があると想定される。 また、この部位は、新規の薬理学的シャペロンをin silicoでスクリーニングするためのファーマコフォアとなる可能性もある。 特に、Gracilariopsis lemaneiformis 33のファミリーGH31 α-1,4-グルカンリアーゼのN末端ドメインにはアカルボース由来の三糖が結合しており、ここで述べた二次基質結合部位に近い位置にある（補足図5）。
N-acetylcysteine is an allosteric pharmacological chaperone
既知の医薬品N-acetylcysteine (NAC) は、触媒活性に影響を与えずに、変異した内在性GAAやERTに用いられるrhGAA の安定性を高めるalosteric pharmacological chaperoneとして作用することがわかっている18。 NACのポンペ病治療への可能性を構造研究によって引き出すために、我々はrhGAAとNACの複合体の結晶構造を追求した。 結晶浸漬実験により得られた1.83Å分解能の複合体構造（表1）により、活性部位から離れた場所に2つのNAC結合部位があることが明らかになり（図4d、e）、機能研究で予想されたように、NACが実際にアロステリックシャペロンであることを構造的に証明することができた18。 我々は活性測定と示差走査蛍光測定により、NACがrhGAAと本研究で生産したタンパク質分解成熟酵素を同様に安定化すること、そしてNACはイネのGH31相同体には安定化効果を示さないため、シャペロンはGAAに対して特異的であることを確認した（補足図6a、b、補足表3、4）。 rhGAA-NAC複合体構造では、NAC1と呼ばれるNAC分子が活性部位から約30Å離れた、(β/α)8バレルと遠位βシートドメインの間の界面に位置している(Fig. 4d)。 NAC1はアミド窒素を介してH432の主鎖カルボキシルに結合し、カルボキシル機能は水を介してD513の側鎖に接触している。 Cβ-Sγ基とアセチル基は、それぞれR437のグアニジン基とループG434-G435とスタッキング相互作用を形成している。 第2の部分的に占有されたNAC分子（NAC2）は、活性部位から25Åの距離にある（β/α）8バレルと近位βシートドメインの界面に留まっている（図4e）。 NAC2のカルボキシル機能はL756の主鎖酸素と水を介して接触し、チオールはQ757の側鎖と、アセチル基はH742の側鎖とそれぞれスタックしている。 NAC2分子はシャペロンDNJやNHE-DNJよりもrhGAAとの相互作用が少なく、弱いものである。 これは、示差走査蛍光測定で得られた11.57±0.74 mMのK D、DNJとNHE-DNJのそれぞれ3.4と3.0 µMのK iに見られるように、シャペロン活性に要するNACの濃度が高い（mM vs. µM）ことを反映している18,29。 実験点に最もよく適合するシグモイド飽和曲線は、NACアロステリックの完全（NAC1）および部分的（NAC2）占有結合部位を支持していた（補足図6c）。 NACに関連するアミノ酸、例えばN-アセチルセリンやN-アセチルグリシンも同様にrhGAAを安定化する効果があるが、非アセチル化アミノ酸は効果がないことから、NAC1およびNAC2のアセチル基とrhGAAの間に確立したスタッキング相互作用は結合エネルギーに大きく寄与するはずである18。 rhGAA-NAC複合体の構造では、NAC結合部位の周囲の残基の原子熱変位パラメータが、結合していないrhGAAのそれに対して減少しており、NACによるドメイン間安定化機能全般を示唆している（補足図7a-d）。 結晶中では、rhGAA-NAC複合体の構造を除くすべての結晶構造で残基C938がスルフェン酸型に酸化されていることから、NACは酸化防止効果も発揮しているようだ（補足図8a, b）。
NACとイミノ糖は異なるシャペロンプロファイルを示す
ポンペ病につながるいくつかの突然変異は、NACとイミノ糖DNJおよびNB-DNJの両方に反応する一方、他のものは一方または他の薬理シャペロンによって特に標的化される16，17，18． イミノ糖のシャペロン活性に反応するGAA変異体の大部分は、活性部位に到達しているか、その全体的な構造に寄与する構造要素に位置している。 ポンペ病患者、線維芽細胞、マウスモデルにおいて、NACに最も反応するGAA変異体（A445P、Y455F、L552P）18は、挿入部IおよびIIに位置し、対応する野生型残基はドメインの安定化に寄与している。 A445はF487とともにインサートIの境界を規定しており、A445P変異体はインサートIの足場全体を不安定化させている可能性が高い（補足図9a）。 インサートIのY455の側鎖水酸基は触媒ドメインの長いループと相互作用し、インサートIIのL552の側鎖はN末端のβシートドメインから残基と疎水性相互作用をする（補足図9b, c）。 それぞれのY455FおよびL552P変異体は、全体的に不安定化する効果があり、これはNACによって明らかに回復される。 したがって、イミノ糖のシャペロン作用は、構造的に不安定な活性部位の構造的救済と考えることができ、一方、アロステリックシャペロンNACの効果は、全体的または局所的な構造ゆらぎの安定化に起因するようである＜1449＞。