要旨
ABCA1およびABCG1遺伝子はコレステロールおよびリン脂質の恒常性に重要な役割を果たしているコレステロール輸送体タンパク質をコードしている. 本研究は、メタボリックシンドローム患者と健常者におけるABCA1およびABCG1遺伝子の発現を評価し比較することを目的とした。 2013年から2014年にかけて、ハマダン(イラン西部)のメタボリックシンドローム患者36名と同数の健常者を対象に、ケースコントロール研究を実施した。 単核細胞からtotal RNAを抽出し、RNeasy Mini Kitカラムを用いて精製した。 ABCA1およびABCG1遺伝子の発現は、qRT-PCRによって行った。 脂質プロファイルと空腹時血糖値は比色法を用いて測定した。 メタボリックシンドローム患者のABCG1発現量は対照群に比べ有意に低かった(約75%)が、ABCA1発現量については両群間に有意差はなかった。 HDL-C、FBS、BMI、ウエスト周囲径、収縮期および拡張期血圧などの他のパラメータをメタボリックシンドローム患者と健常者の間で比較したところ、有意差が認められた()。 メタボリックシンドローム患者におけるABCG1の発現が健常者に比べて低下していることから、トランスポーター能力を超える高血糖、関連代謝物、高脂血症がABCG1の発現を低下させていることが示唆される。 両群間でABCA1遺伝子発現に有意な変化がないことは、ABCA1発現の調節機構が異なることを示唆していると考えられる
1. はじめに
メタボリックシンドローム(MetS)は、糖尿病と心血管疾患(CVD)の相互に関連する一連の危険因子として定義される。 メタボリックシンドロームの臨床診断には、ウエスト周囲径の上昇(男性で102cm以上、女性で88cm以上)、トリグリセリドの上昇(150mg/dL以上、1.5%以上)などが基準としてある。7mmol/L)、高密度リポ蛋白コレステロールの減少(HDL-C<5795>40mg/dLまたは1.03mmol/L、男性<5795>50mg/dLまたは1.3mmol/L)、血圧上昇(収縮期血圧130mmHg以上、拡張期血圧85mmHg以上)などが認められた。 これらのうち3つの基準を満たすことでMetSと診断されます。 過去数年間、MetSの有病率は世界的に増加しているが、米国では1999/2000年の25.5%から2009/2010年には22.9%に減少している。 Weissらは、肥満がMetSの有病率上昇に直接関連していると報告している。 メタボリックシンドロームの基準の一つである血漿 HDL-C 値と CVD の間には逆相関がある。 高密度リポ蛋白は循環リポ蛋白のサブフラクションであり、末梢組織から肝細胞へのコレステロール輸送に重要な役割を担っている。 HDLはApo A-IとApo A-IIタンパク質に富み、その含有量の3分の2以上はApo A-Iです。
ABC膜貫通輸送体は、マクロファージからHDLへのコレステロールの取り込みに重要な役割を持ち、泡沫細胞の形成を減少させる 。 ABCA1は2261個のアミノ酸からなり、ほとんどの組織に存在する。 近年、ABCA1が心血管疾患の予防に重要な役割を担っていることが明らかにされています。 HDLの合成は、肝細胞におけるABCA1活性に直接依存しており、言い換えれば、血漿HDLを増加させることにより、泡沫細胞から動脈細胞を保護する重要な機能を有しているのである。 動脈マクロファージのABCA1活性は泡沫細胞の形成と逆の関係を示しており、その活性が増加すると泡沫細胞の形成が減少する。
ABCA1活性の低下または障害は、2型糖尿病、Tangier病、および早期CVDなどのいくつかの疾患を引き起こす可能性がある。 ABCA1、ABCG1ともに組織中のコレステロールをHDLに排出し、その減少をもたらすが、ABCG1は組織中のコレステロールをHDL2やHDL3に、ABCA1は脂質を含まないApo A-Iに輸送している。 マクロファージはABCA1およびABCG1が作用する最も重要な組織である . 多くの研究で、これらの遺伝子のアップレギュレーションとダウンレギュレーションの効果が調べられた。
コレステロール排出の減少は、in vitroでのABCA1発現不足の結果であり、動脈硬化の増加につながるが、ABCA1のアップレギュレーションは動脈硬化の減少につながる。 ABCG1のダウンレギュレーションも同様にコレステロールの排出に影響を与えるが、ABCG1のダウンレギュレーションが動脈硬化に与える影響については議論のあるところである。 本研究では、コレステロール輸送に重要な役割を持つトランスポーター合成に関わるABCA1およびABCG1遺伝子のMetS患者における発現を評価することを目的とした。 材料と方法
2.1. 対象者
この症例対照研究は、2013年から2014年にかけてハマダン(イラン西部)の病院の内分泌病棟に紹介された患者を対象に実施された。 メタボリックシンドロームの患者36名が選ばれた。 また、年齢と性別をマッチさせた36名の健常者を対照群として選択した。 健常者はいずれもメタボリックシンドロームの基準を持たなかった。
メタボリックシンドローム群に含める基準は、上記の特徴のうち5つ中3つを有することであった。 抗脂質薬、避妊薬、利尿薬の摂取歴のある患者は研究から除外した。 妊娠中の患者、糖尿病、炎症、感染症の患者も除外された
2.2. 血液採取
各被験者の2.5mL血液サンプルをEDTA含有チューブに加え、RNA抽出のために4℃で保存した(2時間後まで)
2.3. 末梢血単核細胞(PBMC)の抽出
PBMCの分離には、Lymphodex(ドイツ)およびHenx(イラン)溶液を使用した。 同量の血液にHenx溶液約2mLを加えて完全に馴染ませた後、Lymphodex溶液3mLに注意深くゆっくりと注いだ。 その後、混合液をLymphodex上に置き、1000 gで20分間遠心分離した。 血漿とLymphodexの間の中間的な白い層を単核細胞(MC)として分離した。その後、HenxバッファーをMC上に加え、完全に混合し、遠心分離した。 最後に上清を捨て、もう1度この操作を繰り返した
2.4. RNA抽出とcDNA合成
RNAの純抽出は、Gene JET RNA Purification kitを用い、メーカーのプロトコルにしたがって実施した。 精製したRNAの質と量をNanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA)を用いて分析した。その後、各RNAサンプルの完全性を1%アガロースゲル、1x TBEを用いて検査した。
RNAをRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) を用いて、以下のプロトコルでcDNAに変換した:ステップ1:プライマーアニーリング 25℃ 5分、ステップ2:cDNA合成 42℃ 60分、ステップ3:熱不活性化 70℃ 5分。 生成物は次のステップのために-80℃で保存された
2.5. プライマー設計
各遺伝子に対する特異的プライマーは、Allele IDソフトウェア(バージョン7.6)を用いて設計した。 リアルタイムPCR反応の特異性を高め、偽陽性を減らすために、各対のプライマーのうち1つはExon-Exon junction領域に付くように設計した。 各遺伝子に対する使用プライマーの徹底的な基準を表1に示す。 内部コントロールとして18S rRNAハウスキーピング遺伝子を使用した。
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C1000 Thermocycler and CFX96 real-time system (Bio-Rad, USA) and SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa No. RR820L) を用いて、各サンプルの threshold cycle (CT) 値を測定し、遺伝子の相対発現量を算出した。 各サンプルの3連アッセイにおけるCTの平均値をCT値とした。 qRT-PCR反応の成分量は、SYBR green 10μL、脱イオン水7μL、フォワードプライマー、リバースプライマー、鋳型各1μLであった。 qRT-PCRは、95℃で30秒間の初期活性化後、95℃で5秒間の変性、各遺伝子の適切な持続時間に最適化したアニール温度でのアニール、72℃で30秒間の伸長を40サイクル繰り返し、最後に72℃から95℃まで0.5℃/0.05秒の温度上昇でデータを取得する条件で実施した。 その後、PCR産物を電気泳動(1%アガロースゲル、1xTBE上)し、アンプリコンの特異性を確認した。
2.6. 血清生化学的因子の評価
各被験者から2ミリリットルの血液サンプルを採取し、3000rpmで10分間遠心分離して血清を分離した。 総コレステロール(TC)、LDL-C、TG、FBS、HDL-Cは日立911(ドイツ)のPars Azmun(イラン)キットを使用して調べた
2.7. 結果の解析と解釈
メタボリックシンドローム群とコントロール群の相対的な遺伝子発現の解析には、計算式を使用した。 各遺伝子について10-2希釈でreal-time PCRの効率を算出し、得られた数値を以下の計算式に当てはめ、遺伝子発現のfold changeを測定した:95%信頼区間での統計解析にはSPSS V.16ソフトウェアを使用した。 変数の正規分布はKolmogorov-Smirnov法で確認し、独立標本検定で2群間の値を比較した。 結果
研究群の人口学的特性および生化学的因子は表2に示したとおりであった。 男女比は各群とも1/3(M12名、F24名)であった。 表2に示すように,年齢とLDL-Cを除くすべての検査項目の差は,2群間で統計的に有意であった()。 メタボリックシンドローム群は健常者に比べ、BMI、LDL-C、TC、TG、FBS、拡張期/拡張期血圧、ウエスト周囲径が高く、HDL-Cはメタボリックシンドロームで有意に低かった。
表2
研究群の基本的特徴
3.1. qRT-PCRの結果PCR反応終了後、反応曲線の解析、生成物の融解曲線、PCR生成物の電気泳動により結果を確認した。 電気泳動は100 bpのDNAラダーを用い、1%アガロース上で行った。 その結果を図1に示す。 図1
RT-PCR 産物のアガロースゲル電気泳動結果。 レーン1:135bpのABCG1産物;レーン2:151bpの18S RNA産物;レーン3:100-1000bpの分子量標準;レーン4:<100bpのネガティブコントロール;レーン5:180bpのABCA1産物。
3.2. PBMCにおける遺伝子発現の評価末梢血単核細胞における遺伝子の発現量を測定し、各遺伝子のΔCTを算出することにより2群間で比較した。 ABCA1の発現量は2群間で差がなかったが、ABCG1の発現量はMetS群で有意に低かった()。 詳細な結果を表3に示す。
表3
ABCA1とABCG1遺伝子のCTを2群間で比較。
またABCG1発現量のfold change ()を算出すると、MetS群で3.1倍低い発現量を示した。 4. 考察ABCA1およびABCG1はマクロファージなどの末梢組織から肝臓へのコレステロールの逆輸送に重要な役割を持つ。 しかし、いくつかの疾患においてABCA1およびABCG1遺伝子の発現が研究されている。 しかし、メタボリックシンドロームにおけるこのテーマに関する報告は見つかりませんでした。 今回、メタボリックシンドロームの被験者と健常者を対象にこれらの遺伝子の発現を調べたところ、 ABCA1遺伝子の発現には両群間に有意差はなかったが、ABCG1の発現は対照群に比べメタボリックシンドロームの被験者で有意に低い(約75%)ことが判明した。 Singarajaらは、マクロファージや腎臓におけるABCA1の減少が、コレステロール量の増加と関連していることを示した 。 彼らは、ABCA1を介したコレステロール輸送の障害は、糖尿病に伴う動脈硬化や腎臓病の増加に寄与していると結論づけた。 これらの遺伝子の発現を制御している可能性のあるメカニズムについて、いくつかの報告がなされている。 最近、ABCA1およびABCC8の多型がメタボリックシンドロームと関連する可能性が示されました。 ABCA1遺伝子に変異があると、家族性低アルファリポ蛋白血症が引き起こされ、低HDLとコレステロールエステル沈着が組織や細胞で増加することが明らかになっている。 また、ABCA1遺伝子の過剰発現は動脈硬化の予防につながることが示されている。 これらのデータは我々の知見と一致し、ABCA1遺伝子の発現低下がメタボリックシンドロームの合併に寄与するという考えを支持するものである。 Haghpassand らは、PBMC における ABCA1 遺伝子発現とコレステロールの負荷が直接関係し、 ABCA1 が過剰発現すると過剰なコレステロールがアポタンパク質に移行することを示した。 WangらはABCA1およびABCG1ノックダウンマウスを用いて逆コレステロール輸送を検討し、ABCA1とABCG1の両方をノックダウンした場合、ABCG1ノックダウンと比較して逆コレステロール輸送が大きくなると結論付けている Mauererらは高グルコース(高血糖)が試験管内でのABCA1とABCG1の発現低下に関わっていると指摘しており、メタボにおいても同様の変化が起こると考えるのが自然であろう。 ABCA1やABCG1のプロモーターはLXRやRXRの受容体部位を持っており、オキシコレステロールやレチノイン酸がこれらの因子に結合すると、ABCA1やABCG1の発現が増加する。 また、cAMPとNFκBはそれぞれABCA1とABCG1の転写因子である。 得られた結果から、メタボリックシンドローム患者では健常者と比較してABCG1の発現が有意に低下していることが明らかとなった。 これらの結果は、トランスポーター能力を超える高血糖、関連代謝物、高脂血症がABCG1の発現を低下させる可能性を示唆するものである。 ABCA1遺伝子の発現には有意な変化が見られなかったことから、別の制御機構によるものと考えられる。 これらの遺伝子は構造が異なり、多様な転写因子によって制御されていることから、今回の結果は正当化される。 しかし、本研究ではサンプル数が限られていることも、ABCA1の発現に変化が見られなかった要因の一つである。 もう一つは、被験者のPBMCにおけるこれらの遺伝子の発現を調べたことである。単球におけるこれらの遺伝子の発現変化は、肝臓や腸といったHDL合成の主要部位である他の主要組織における変化と異なる可能性に注目することが重要である。 さらに、mRNAレベルの変化は必ずしも関連するタンパク質の変化を意味しない。 利益相反著者らは利益相反がないことを宣言する。 謝辞この論文はZahra Tavoosiの修士論文から抽出したものである。 本研究を財政的に支援したHamadan University of Medical Sciencesに謝意を表したい。 |