擬似剥離緑内障患者における8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine（8-OHdG）の血漿レベルの上昇

Abstract

目的。 偽剥離緑内障（PXG）患者における全身的な酸化ストレスによるDNA損傷を調べるため、酸化的DNA損傷のマーカーである8-hydroxy-2′-deoxyguanosine（8-OHdG）の血漿レベルをコントロールと比較しながら推定した。 さらに、リシルオキシダーゼ様1（LOXL1）多型の状態と8-OHdGレベルのPXGリスクへの複合効果も検討した。 材料と方法 PXG患者41名と非白内障対照者45名における8-OHdGの血漿レベルを、酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて推定するレトロスペクティブケースコントロール研究が行われた。 アッセイは自動ELISA装置で二重に行われた。 LOXL1遺伝子に共通する2つの多型（rs1048661とrs3835942）をサンガーシークエンスでジェノタイピングした。 結果 8-OHdGの平均値および中央値は、PXG症例（）および男性被験者（）において有意に上昇した。 第3四分位値（75％パーセンタイル）を超えるレベルの被験者は、PXGの有意なリスク増加を示した（オッズ比＝4.06、95％信頼区間（CI＝1.11-14.80、））。 グループ内およびグループ間の比較では、LOXL1リスク変異体（G/G）を持つ個体で平均値が高かったが、統計的な有意差は認められなかった。 ロジスティック回帰分析では，8-OHdG（）とrs3835942（）の両方が，PXGの結果に統計的に有意な影響を与えた． しかし、年齢、性別、rs1048661を含めると、その効果は失われた。 8-OHdG 値と眼圧（、）および cup/disc 比（、）には有意な正の相関が認められた。 さらに、受信機動作特性解析では、曲線下面積は0.635（95％CI = 0.518-0.751）という値を示し、統計的に有意であった（）。 結論 本研究は、PXG患者における8-OHdGの血漿レベルの増加との関連を示し、PXG発症における酸化ストレスの役割、および酸化的DNA損傷の増加を支持するものである

1. はじめに

緑内障は、サウジアラビアを含む世界中で不可逆的な失明の主要原因の1つである。 眼圧の上昇は、網膜神経節細胞（RGC）の死とRGC軸索の喪失を引き起こし、緑内障性視神経症を引き起こす主要な危険因子と考えられています。 偽剥離緑内障（PXG）は、主に瞳孔縁に沿った前眼部での異常な線維性外膜物質の蓄積を特徴とし、この疾患の病的な特徴と考えられています。 一般的な原発開放隅角緑内障（POAG）と比較して、PXGの患者は、より高い眼圧、大きな陥凹、重度の視野障害、疾患の急速な進行による悪い予後など、より積極的な臨床経過を示すことが多い ……とされています。 サウジアラビアにおけるPXGの正確な有病率を知るための系統的な疫学的研究は、文献上では不足している。 しかし、リヤドにあるキング・アブドゥルアジーズ大学病院の緑内障科に登録された約600件の新規緑内障症例のうち、PXGと診断されたのは10％未満であることが観察されています。 この疾患は、遺伝的要因と環境的要因の両方が病因病態に関与している。 リシルオキシダーゼ様1（LOXL1）は、サウジアラビア人を含む複数の民族でPXG発症のリスクに寄与していると報告されている有力な候補遺伝子である。 LOXL1 は、細胞外マトリックスの形成と安定性に関与している。 PXG の病因に酸化ストレスのメカニズムが関与していることを示唆する強力な証拠がある。 酸化ストレスは一般に、スーパーオキシド、過酸化物、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種（ROS）の形成によって引き起こされ、フリーラジカルを開始し増殖させることができる . 細胞内の活性酸素の蓄積は、脂質、タンパク質、RNA、DNA、ミトコンドリアなどの高分子の酸化的損傷を誘発し、その結果、細胞の機能不全やアポトーシスを引き起こします。 酸化ストレスは、眼房水の流出経路を阻害し、眼房水の変性を開始することによって、眼圧を上昇させることが証明されている。 ミトコンドリアにおける変異、ハプログループ、呼吸活性の低下もまた、様々なタイプの緑内障と関連している。 また、過酸化脂質や様々な有害毒素の解毒に関与する酵素であるグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子の多型も緑内障と関連している。 GST活性の低下は、酸化代謝物の解毒を妨げ、酸化ストレスによる視神経へのダメージを悪化させる可能性があります。 生体試料の総抗酸化状態（TAS）は、酸化ストレスの重要な指標であり、酸化状態を予測する有用なツールである 。 我々の以前の研究では、PXG患者の血漿TASレベルは対照群と比較して有意に低く、PXGの病因における酸化ストレスの役割を支持するものであった 。 さらに、我々は、LOXL1対立遺伝子とTASの減少が複合的に作用して、PXGの全体的なリスクに寄与している可能性も報告した。 ヒトでは、緑内障患者のTM細胞において、酸化的DNA損傷が有意に多いことがin vivo実験により証明されている。 さらに、眼圧上昇と視野障害の両方が、TM細胞に影響を与える酸化的DNA損傷の量と有意に関連していた 。 酸化ストレス/活性酸素は、DNAに切断や塩基修飾を引き起こし、8-ヒドロキシ-2′-デオキシグアノシン（8-OHdG）などのDNA酸化生成物を放出させることがある。 8-OHdGはDNAの酸化生成物の一つであり、容易に定量化できるため、酸化的DNA損傷を評価するバイオマーカーとして一般的に使用されている

この研究の目的は、PXG患者における全身性酸化ストレス誘発DNA損傷について調べることであった。 酸化的DNA損傷のマーカーとして血漿中の8-OHdG濃度を推定し、非白内障の健常対照者と比較した。 さらに、LOXL1多型の有無と8-OHdG値の組み合わせがPXGのリスクに与える影響についても検討した。 材料と方法

2.1. 研究対象者

本研究はヘルシンキ宣言の教義を遵守し、施設審査委員会および研究倫理委員会の承認を得た（承認番号#08-657）。 サウジアラビアのリヤドにあるキング・アブドゥルアジーズ大学病院にて，書面によるインフォームドコンセントの後，PXGの臨床診断が確立したサウジアラビア出身の被験者（）および民族的にマッチした健常対照（）を本研究のために募集した。 患者および対照者の参加-除外基準は、以前に記述されている

2.2. 血漿およびDNAの調製

血漿サンプルはEDTA血液から5500×gで5分間遠心分離した後に得た。 illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) を用いてバフィー層からDNAを抽出した。 保存は使用時まで-80℃にて行った。 8-Hydroxy 2′-Deoxyguanosine の血漿レベルの推定

8-OHdG レベルの推定は、競合サンドイッチ酵素結合免疫吸着法 (ELISA) に基づく市販キット (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) を使用して行った。 アッセイは、ChemWell-T 自動 ELISA アナライザー（Awareness Technology Inc.、米国フロリダ州）を用いて、製造者の指示に従って二重に行った。 8-OHdGレベルは、標準曲線を利用して確立され、ng／mLで表された＜748＞＜1080＞2． LOXL1 Sanger Sequencing

DNA サンプルは、2つの共通の LOXL1 遺伝子多型 (rs1048661 および rs3825942) について、他の場所で説明されているプライマーおよび増幅条件を使用して配列決定された

2.5. 統計解析＜7565＞＜1413＞データは、連続変数については平均値±SDおよび中央値で、カテゴリー変数についてはカウントおよびパーセンテージで表示される。 8-OHdGレベルの正規性検定はKolmogorov-Smirnov検定を用いて行った。 群間の平均差はStudentのt-testで検定した。 患者と対照の中央値を比較するために、Mann-Whitney U 検定を使用した。 カテゴリー変数は、カイ二乗検定および該当する場合はフィッシャーの正確検定で検定した。 相関性検定はPearsonの方法で行った。 平均8-OHdG値および他の危険因子が疾患転帰に及ぼす影響と効果を推定するために、バイナリロジスティック回帰分析を行った。 受信者動作特性（ROC）曲線を作成し、曲線下面積（AUC）値をMann-Whitney検定で分析した。 オッズ比（OR）を算出し、信頼区間（CI）を95％とした。 統計学的検定はすべて両側で行い、0.05未満を統計的に有意とした。 統計解析はSPSS version 19.0 (IBM Corp., Armonk, New York, USA) およびStatView software version 5.0 (SAS Institute, Cary, NC) を用いて行った。 結果

3.1. 研究集団と8-OHdGレベル

表1に示すように、年齢、性別、全身疾患の状態、喫煙、緑内障の家族歴について、PXG症例と対照群の間に有意差はなかった。 8-OHdG値の正規性検定では、歪んだ分布を示した（）。 8-OHdG値の平均値、中央値ともに、PXG症例および男性被験者では、対照群と比較して有意に上昇していた（表1）。 図1(a)(b)は、それぞれ病態と性別分布に応じた8-OHdG値の箱型プロット表示である。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

図1

8-

ボックスプロットは、8-メトキシシリコンの分配を示す。ヒドロキシデオキシグアノシンは、(a)偽剥離緑内障(PXG)の症例と対照の間のレベル。 (b) 男性と女性、(c) LOXL1 rs1048661 遺伝子型、(d) LOXL1 rs3825942 遺伝子型。 差は、研究グループ内およびグループ間の両方で、Mann-Whitney U検定によって検定された。 有意性は、(a)と(b)で示したように、症例と対照の間、および対照男性対PXG男性の間でのみ観察された。 その他の有意な分布は観察されなかった。

3.2. 8-OHdGのレベルとPXGのリスク

8-OHdGのレベル上昇に伴うPXGのリスクを評価するために、8-OHdG濃度を50パーセンタイル（または中央値）および四分位で二分した（ケースとコントロールとして分類しない）（表2）。 8-OHdG濃度の全体のカットオフ値（中央値）は17.68ng/mLであった。 症例はこの値で疾病リスクの増加を示したが（OR = 1.76, 95% CI = 0.75-4.15）、その差は有意ではなかった（）。 同様に、四分位分布を用いて、10.08ng/mL（第1四分位または25パーセンタイル）と27.72ng/mL（第3四分位または75パーセンタイル）の2つのカットオフ値を確認した。 この2つのカットオフ値を用いて、被験者は3つのグループに分類された：第1四分位未満、四分位間、第3四分位以上である（表2）。 全体として、8-OHdGとPXGの結果の増加による有意な相加効果は見られなかった（χ2 = 4.87, df = 2; ）。 さらに、8-OHdGレベルが第一四分位値（<10.08 ng/mL）未満の被験者と比較して、四分位値間の被験者は有意ではない疾患のリスク増加を示した（OR = 2.50, 95% CI = 0.81-7.0; ）。63, )、一方、第3四分位値（75パーセンタイル）より大きいレベルの被験者は、PXGの有意なリスク増加を示した（OR = 4.06, 95% CI = 1.748>

— – – 8-OHdG ng/mL No.of cases (%) No. 対照群数(%) Ods ratio 95% confidence interval valuea 中央値 <17.68 17 (41.4) 25 (55.5) Reference – ≧17.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.68 24 (58.5) 20 (44.5) 1.76 0.75-4.15 0.190 四分位数別 † <10.08 6 (14.6) 15 (33.3） Reference – 10.08-27.72 22 (53.6) 22 (48.8) 2.8 (48.8) 2.8 (48.8) – – – 0.81-7.63 0.103 >27.72 13 (31.7) 8 (17.8) 4.06 1.11-14.80 0.029

注. aChi二乗検定；†first quartile (<25th percentile); interquartile (25th-75th perptile); third quartile (>75th percentile)を含む。

表2

8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) の中央値と四分位値による偽剥離緑内障リスクの評価

3.3. 8-OHdGレベルとLOXL1多型

さらに、PXG症例とコントロールにおけるLOXL1遺伝子の多型rs1048661 (g.5758 G>T) とrs3825942 (g.5758 G>A) の8-OHdGレベルに対する遺伝子型の影響も調査した。 全体として、表3に示すように、LOXL1多型ともに8-OHdGレベルと遺伝子型の違いに有意差はなかった（図1（c）、図1（d））。

rs1048661については，G/Gが最も多い遺伝子型で，次いでG/T，T/Tであった． T/Tのホモ接合は，対照群では1つだけであったのに対し，患者群では全く観察されなかった。 8-OHdGの平均値は、G/T、T/T、G/T + T/Tグループに比べ、G/G遺伝子型が最も高いことが観察された。 しかし、これらのレベルは、研究グループ比較の両方において有意な変化はなかった。

同様に、rs383592については、G/Gが最も多く、G/AとA/Aの遺伝子型がそれに続き、後者はPXG患者には存在しないことが示された。 G/Gは，G/A，A/A，G/A + A/A群に比べ，8-OHdGの最高値を示す最も一般的な遺伝子型であった。 G/Gの遺伝子型では、症例と対照の間に有意な差はなかった（）。 また、対照群におけるグループ内比較でも、G/A（）、A/A、（）、G/A + A/A（）において、G/G遺伝子型と比較して8-OHdGに有意な遺伝子型の影響は認められなかった＜748＞＜1080＞3.4. 8-OHdGレベルとその他の危険因子

PXG患者における年齢、性別、LOXL1多型、8-OHdGレベルの影響を調べる目的で、疾患あり／なしを従属変数（アウトカム）として2値ロジスティック回帰分析を実施した。 その結果、8-OHdG（）およびrs3835942（）は、いずれも疾患転帰に統計的に有意な影響を及ぼすことが示された。 しかし、年齢、性別、8-OHdG、rs1048661、rs3835942を組み合わせた解析では、これらの危険因子はいずれもPXGに有意な影響を示さなかった（表4）。

3.5. PXG患者における8-OHdGと他の緑内障指標の相関

8-OHdGと眼圧（、）、カップ/ディスク比（、）の間には、年齢（、）、抗緑内障薬の服用回数（、）とは相関がないが、有意な正の相関が認められた

3.6. ROC曲線と8-OHdG

PXG患者とコントロールの8-OHdGレベルのROC曲線分析では、統計的に有意な（）0.635（95％CI = 0.518-0.751）のAUCが得られ、8-OHdGのプラズマレベルがPXG患者とコントロールを満足に識別できることを示しています。

4.考察

活性酸素の増加、酸化的損傷、プロオキシダント状態と抗酸化状態の間の不均衡は、緑内障性神経変性の重要な要因である。 本研究では、PXG 患者において、酸化ストレスによる DNA 損傷のマーカーである全身の 8-OHdG レベルが上昇していることを報告しています。

DNA損傷は、電離放射線、紫外線、有毒化学物質/金属イオン、細胞の通常の酸素代謝の結果として発生する活性酸素などの外因性および内因性の両方の要因によって引き起こされることがある。 生体内で進行する DNA 損傷の原因となりうる内因性プロセスには、酸化的メチル化、脱プリン酸、脱アミノ化が含まれる。 活性酸素によって引き起こされる損傷には、塩基や糖の損傷、タンパク質やDNAの架橋、一本鎖や二本鎖の切断が含まれる。 また、グアニン塩基は酸化還元電位が最も低いため、酸化的修飾を受けやすい。 ヒドロキシルラジカルによるグアニンの酸化的修飾によって生成する最も一般的な副産物は、8-ヒドロキシグアニン (8-OH-Gua) とその 2′-deoxynucleoside equivalent, 8-OHdG で、これは DNA に対する酸化的損傷の優れたマーカーであることが提唱されている . 多くの研究が、8-OHdGの増加と緑内障性視神経症との関連性を強く立証している。

ろ過手術中に得られたヒトTM標本に関する最初の研究では、緑内障患者に高濃度の8-OHdGが存在することが証明された。 Sorkhabiらによる15人のPOAG患者と13人のPXG患者を含む研究では、対照群と比較して、患者の房水（AH）および血清の8-OHdG濃度が高かった。 同様に、原発閉塞隅角緑内障の患者でも、健常者と比較して血清8-OHdGが高値であることが報告されている。 結城と坪田は、正常眼圧緑内障の患者において、尿中8-OHdG/クレアチニン値の上昇が緑内障性視野の進行と関連することを報告した。 同様に、Mohantyらによる最近の研究では、POAG患者では血漿およびAHの8-OHdGレベルが、白内障対照群と比較して有意に高かった。 この効果は、塩基除去修復経路のDNA修復酵素の発現が低下していることに起因するものであった。 さらに、この研究では、全身（血漿）8-OHdGレベルとAH 8-OHdGレベルの間に強い正の相関があり、全身8-OHdGレベルが目の局所8-OHdGレベルを予測することができることが報告されています。 8-OHdGは最も特徴的な酸化的病変の一つであり、C：GからA：Tへのトランスバージョン変異を生じさせることができる。 DNAの損傷の中には、生体内のDNA修復機構によって、損傷したDNAが切断され、細胞内で修復されるものもある。 しかし、これらの損傷が修復されないと、深刻な生物学的影響を及ぼし、発癌や神経変性疾患の発症につながる可能性がある . また、8-OHdGはテロメア短縮を著しく促進し、生体内の生理的および病理的な状態に寄与する可能性があります。 さらに、8-OHdG は、酸化ストレスを受けた細胞において、エピジェネティックな遺伝子転写調節の役割を担っている可能性が示唆されています。 さらに、酸化ストレスや活性酸素が、眼圧上昇や低酸素、TM変性、グリア細胞障害、オートファジー、mtDNA障害、N核カッパB活性化、ペルオキシナイトライトストレス、アポトーシスや炎症経路を刺激する眼内血行動態を経て緑内障発症に異常影響を与え、RGC死や視神経障害を促進することがよく知られています …さらに、8-OHdGが緑内障発症に関与することが示唆されています。

LOXL1遺伝子のrs1048661とrs3825942という2つのミスセンス変異とPXGの強い関連は、サウジアラビア人を含む複数の民族で一貫して再現されている。 PXGの病態とこの遺伝子の関連についての完全な理解はまだなされていないが、多くのメカニズムが想定されている。 エラスチン形成への影響、LOXL1発現の変化、スプライシング効果、あるいは実際の未同定機能性対立遺伝子との関連・連関の可能性などである。 我々は、8-OHdGに対するこれら2つの一般的な変異体の遺伝子型効果、およびPXGのリスクに対するこれらの複合効果について調査した。 遺伝子型は、リスク（G/G）バリアントで高い値を示したが、8-OHdGの値に影響を与えることはなかった。 8-OHdGとrs3835942はともにPXGの有意な危険因子であることが判明した。 しかし、年齢、性、rs1048861の遺伝子型も含めた複合解析では、この有意性は失われた。 748>

眼圧の上昇と視野障害は、TM細胞における酸化的DNA損傷の量と有意に相関している。 同様に、我々の研究では、眼圧とカップ/ディスク比も8-OHdGレベルと有意な正の相関を示し、疾患の重症度のマーカーとしての可能性を示唆した。 さらに、緑内障の病態生理において、抗酸化防御機構と酸化ストレスの間に逆相関があることを支持する報告が多数ある。 我々のグループでも以前、PXG患者において血漿中の総抗酸化力状態（TAS）が対照群と比較して有意に低下していることを報告した。 興味深いことに、PXG患者の8-OHdGとTASの間に有意な負の相関を示した本研究では、PXG患者のTASレベルが入手可能であり（対照群では不可、データなし）、PXGにおける酸化ストレスの増加と抗酸化防御機構の低下のもっともらしい役割を支持するものだった。 まず、全身的な8-OHdGの増加は、前眼房の状況を正確に反映していないかもしれないという事実を認めなければならない。前眼房では、細胞や組織が常に大量のフリーラジカルによる刺激にさらされており、酸化ストレス機構を通じて緑内障の発症と進行により直接的に関与している。 このため、AHサンプルでの検証を追加する必要がある。 第二に、本研究は純粋に記述的なものであり、PXGにおける8-OHdGの上昇について、時間的、機構的な証拠を提供したり、因果関係を示唆するものではありません。 最後に、この研究では比較的少数のサンプルを調査している。 もっと大規模なコホートで再現すれば、この研究の観察結果は確実に強化されるだろう。 それでも、PXGの症例と対照の間で観察された8-OHdG濃度の13 ng/mLの平均差（効果量）、平均標準偏差20、タイプIエラー0.05（両側）を考えると、この研究は>80％の検出力を示している

5. 結論

結論として、本研究は、PXG患者における全身性8-OHdGのレベルの増加を示し、このマーカーとPXGの関連性を支持し、PXGの病因における酸化ストレスおよび酸化的DNA損傷の増加のもっともらしい役割を支持するものです。

Ethical Approval

この研究はヘルシンキ宣言の教義を遵守し、サウジアラビア、リヤドのキングサウド大学医学部の施設審査委員会と研究倫理委員会から承認を受けていた。

同意

本研究に参加する前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

利益相反

著者は利益相反を報告しない。 資金提供者は、研究のデザイン、データの収集、分析、解釈、原稿の執筆に関与していない。

謝辞

著者らは、この研究の支援を受けたキングサウド大学の科学研究副官椅子と眼科のグルアコーマ研究椅子に感謝する

。