4-1BB/4-1BBL 相互作用は脂肪細胞/マクロファージの双方向炎症シグナルを誘発することにより肥満誘発性脂肪炎症を促進する

Abstract

肥満による脂肪炎症は、脂肪組織へのマクロファージの動員および炎症サイトカインの放出が特徴的である。 コスティミュレーション受容体である4-1BBは，免疫細胞表面上のリガンド4-1BBLとの相互作用を通じて炎症プロセスを調節している。 本研究では、脂肪細胞とマクロファージの間の4-1BB/4-1BBL相互作用が、肥満による脂肪の炎症に関与しているかどうかを検討した。 その結果、4-1BBは脂肪細胞上に発現し、肥満関連因子により発現が上昇し、マクロファージ上の4-1BBL発現も上昇することを見出した。 4-1BBおよび/または4-1BBLアゴニストは、それぞれ脂肪細胞およびマクロファージにおいて炎症性シグナル分子（MAPK/IκBαおよびMAPK/Akt）を活性化し、炎症性サイトカイン（MCP-1、TNF-αおよびIL-6）放出を促進した。 さらに、4-1BB/4-1BBLの相互作用を破壊すると、接触培養した脂肪細胞/マクロファージからの炎症性サイトカインの放出が減少した。 これらの知見は、脂肪細胞／マクロファージにおける4-1BB/4-1BBLを介した双方向のシグナル伝達が、脂肪の炎症を促進することを示している。 4-1BBおよび4-1BBLは、肥満による脂肪の炎症から保護するための有用なターゲットとなる可能性がある

1. はじめに

肥満による炎症は、インスリン抵抗性、2型糖尿病、心血管疾患などの代謝異常の原因であると考えられている。 脂肪組織はマクロファージやT細胞の動員、炎症性サイトカイン（単球走化性タンパク質-1、MCP-1；腫瘍壊死因子α、TNF-α；インターロイキン-6、IL-6）の放出を通じて肥満誘発性炎症に積極的に関与し、脂肪細胞の分化、代謝、局所/全身炎症反応を調節して望ましくない代謝のアンバランスを引き起こす . 興味深いことに、最近の研究では、脂肪細胞とマクロファージを直接接触させて共培養すると、炎症性サイトカインの放出が著しく上昇することが示されており、これらの細胞の細胞表面分子間の相互作用が炎症反応を促進するために重要であることが示唆されている。

4-1BB（CD137、TNFRSF9としても知られる）はコスティミュレーション分子の典型例であり、炎症部位で活性化T細胞に発現する炎症受容体としてよく知られている。 T細胞上の4-1BBを刺激すると、細胞の膨張、サイトカインの産生、細胞溶解エフェクター機能の発達をもたらす。 4-1BBリガンド（4-1BBL、CD137LおよびTNFSF9としても知られる）は、ほとんどの免疫細胞および多くの非免疫細胞に高度に発現し、マクロファージなどの細胞への逆信号を受信し伝達することができる . 蓄積された証拠から、免疫細胞における細胞表面の4-1BB/4-1BBL相互作用は、様々な炎症反応（例えば、関節リウマチ、自己免疫性心筋炎、血液学的悪性腫瘍）の開始と調節に重要であることが示されている。 さらに、4-1BB/4-1BBLを介した相互作用は、免疫細胞と非免疫細胞の間でも起こり、ここでも炎症反応に影響を与える。 例えば、内皮細胞とマクロファージの4-1BBと4-1BBLの相互作用は血管の炎症に関与し、上皮細胞とナチュラルキラー細胞の2つの分子の相互作用は腎臓虚血再灌流障害に関与している . 我々は、肥満により炎症を起こした脂肪組織で4-1BBと4-1BBLの発現が上昇し、4-1BBのアブレーションにより脂肪の炎症が抑制されることを以前に明らかにした 。 従って、脂肪細胞上の4-1BBと4-1BBLとマクロファージなどの免疫細胞の相互作用が、肥満における脂肪の炎症に関与していると考えている。

本研究では、4-1BBが脂肪細胞に発現し、肥満関連因子によって発現が上昇することを初めて示し、脂肪細胞/マクロファージにおける4-1BB/4-1BBLを介した双方向シグナルが、肥満による脂肪炎症カスケードの開始と促進に重要な役割を果たすことを明らかにした。 材料と方法

2.1. 動物

C57BL/6マウス（雄、8週齢）（Orient Ltd., Busan, Korea）に高脂肪食（HFD, 60% of calories from fat (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); obese mouse）または低脂肪食（LFD, 10% of calories from fat (Research Diets); nonobese mouse）を9週間摂取させました。 すべての動物実験は、蔚山大学の動物倫理委員会の承認を受け、米国国立衛生研究所のガイドラインに準拠した

2.2. 抗体

ヌードマウスをプリスタンでプライミングし、4-1BB（3E1）に対するアゴニスティックモノクローナル抗体（Ab）を産生するサブクローンハイブリドーマを腹腔内に注射して腹水形成を誘導した。 このモノクローナルAbは、protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって腹水から精製された。 リコンビナント4-1BB Fc (r4-1BB Fc)はAdipogen (Seoul, Korea)から購入した。 4-1BBLに対する拮抗モノクローナルAb（TKS-1）は、e-Bioscience（San Diego，CA，USA）より購入した。 ラット免疫グロブリンG（Rat IgG）およびヒトIgG1は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入し、コントロールとして使用した

2.3. 細胞培養および処理

マウスマクロファージ細胞株Raw264.7は、Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Seoul, Korea)から入手した。 この細胞株は、10% (vol/vol) FBS (fetal bovine serum) (Gibco BRL, NY, USA) を含むRPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) で維持し、37℃、加湿5% CO2でインキュベートされた。 3T3-L1前脂肪細胞は、10％FBSを含むDMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）高グルコース（Gibco BRL, NY, USA）中で維持した。 コンフルエントな3T3-L1前脂肪細胞（0日目）を、10μg/mLインシュリン（シグマ・アルドリッチ）、0.25μM DEX（デキサメタゾン、シグマ・アルドリッチ）、0.5mM IBMX（3-イソブチル-1-メチルキサンチン、シグマ・アルドリッチ）及び10％FBSを含むDMEM中で2日間インキュベーションさせた。 簡単に言うと、3T3-L1細胞は、10% FBSおよび5μg/mLインスリンを含むDMEM中で2日間インキュベートすることにより成熟脂肪細胞に分化させた。 成熟脂肪細胞はこの培地で維持し、培養液は2日ごとに新鮮な培地に交換した。 遊離脂肪酸（FFA、パルミチン酸混合物、シグマ・アルドリッチ）は、ウシ血清アルブミン（BSA、25μM）を含むエタノールに溶解し、使用前にBSAと10：1のモル比で抱合させた。 24ウェルプレートに3T3-L1脂肪細胞（3 × 105 cells/well）またはRaw264.7マクロファージ（3 × 105 cells/well）を入れ、それぞれ24時間または4時間肥満関連因子（palmitic acid : pal, lipopolysaccharide : LPS）で処置した。 脂肪細胞上の4-1BBを刺激するために、24ウェルプレート上の3T3-L1脂肪細胞をアゴニスト4-1BB Ab (3E1, 1 μg/mL) またはラットIgGと無血清培地中で48時間インキュベートした。 r4-1BB FcまたはヒトIgG1を培養プレート上に固定化するために、r4-1BB FcまたはヒトIgG1を24ウェルプレート中で37℃、1時間CO2インキュベーターでインキュベートし、ウェルをリン酸緩衝塩水（PBS）でリンスした。 その後、RPMI (10% FBS) を用いてCO2インキュベーター内で37℃、1時間インキュベートし、ウェルをPBSでリンスした。 Raw264.7マクロファージを、100 ng/mL r4-1BB FcまたはヒトIgG1でプレコートした24ウェルの平底プレートで5×105細胞／ウェルで24時間インキュベートした

2.4. 脂肪組織からの間質血管細胞の単離

脂肪組織の間質血管画分（SVF）を単離するために、C57BL/6マウス（雄、8週齢）の副睾丸脂肪パッドをミンチにしてDMEM（pH7.4）中のタイプ2コラゲナーゼ（1mg/mL；Sigma-Aldrich）で37℃にて30分間消化させた。 得られた懸濁液を500 gで5分間遠心分離した。 ペレットを赤血球溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を室温で3分間インキュベートした後、500 gで5分間遠心分離を行った。 DMEMで洗浄後、懸濁液を滅菌した100μmナイロンメッシュ（SPL Lifescience, Pocheon, Korea）に通した。 濾過した細胞を10% FBSと0.4% Fungizoneを添加したDMEMを含む100 mm2ディッシュに移し、37℃、5% CO2でインキュベーターで維持した。 細胞は接着させ、浮遊細胞は吸引によって除去し、培養液は1日ごとに補充した。 2日後にSVF細胞を回収した。 SVF細胞は、24ウェルプレートに5×105cell/wellでプレーティングした。 コンフルエントなSVF由来の前脂肪細胞を、10μg/mLのインスリン（シグマアルドリッチ）、0.25μMのDEX（シグマアルドリッチ）、0.5mMのIBMX（シグマアルドリッチ）、および10％のFBSを含むDMEMで2日間処理し、脂肪細胞へ分化させた。 成熟脂肪細胞は、2日ごとに新鮮な培地と交換した培養液で維持した。 肥満因子に曝されたSVF由来脂肪細胞における4-1BB及び4-1BBLの発現を検出するために、これらの細胞をパルミチン酸250μM、LPS100ng／mLと24時間インキュベートした＜7506＞＜7396＞2． 腹膜マクロファージの単離＜4426＞＜3184＞C57BL／6マウス（雄、8週齢）に、殺される4日前に3％チオグリコレートブロス（Difco，Detroit，MI，USA）3mlを腹腔内投与した。 腹膜マクロファージをMEM培地（Minimum Essential Medium, Gibco）中で遠心分離して集め、得られたペレットを洗浄し、10％FBSを含む培養液MEMに再懸濁させた。 腹膜マクロファージは、組織培養プレートに2時間付着させて精製した。 肥満因子に暴露された腹膜マクロファージにおける4-1BBおよび4-1BBLの発現を検出するために、これらの細胞をパルミチン酸250μM、LPS100ng/mLと4時間インキュベートした。 脂肪細胞とマクロファージの共培養

3T3-L1 脂肪細胞を6日間培養し、分化させた。 脂肪細胞とマクロファージの共培養は、直接接触共培養とトランスウェル共培養の2つの方法によって行った。 直接接触方式では、3T3-L1脂肪細胞（3×105個）を含む24ウェルプレートにRaw264.7マクロファージ（3×105個：マクロファージ50%、3×104個：マクロファージ10%）または腹膜マクロファージ（3×105個）を配置した。 細胞同士を接触させて24時間培養した後、採取した。 コントロールとして、脂肪細胞とマクロファージも別々に培養し、ウェルあたりの細胞数は接触系と同じにして、収穫後に混合した。 トランスウェル系では、0.4μmの多孔質膜を有するトランスウェルインサート（Corning, NY, USA）を用いて、脂肪細胞（3 × 105 cells, lower well）とマクロファージ（3 × 105 cells, upper well）を分離し、細胞を共培養した。 4時間、8時間、12時間培養した後、上清を採取した

2.7. サイトカインレベルの測定

培養上清中のサイトカインレベルは、酵素結合免疫吸着法(ELISA)を用いて測定した。 アッセイは、OptEIAマウスTNFα、マウスMCP-1セット（BD Bioscience Pharmingen, CA, USA）およびマウスIL-6およびアディポネクチンセット（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）、ならびにIL-10キット（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を用いて実施された。 サイトカインレベルの値は、カーブフィッティングプログラムSOFTmax（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）を用いて標準曲線から導き出した

2.8. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

培養細胞から抽出した全RNAを逆転写し、M-MLV逆転写酵素 (Promega, Madison, WI, USA) を用いてcDNAを生成した。 cDNAのリアルタイムPCR増幅は、SYBR premix Ex Taq kit (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) を用いて、Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japan) で二重に実施した。 すべての反応は同じ手順で行った：95℃、10秒の初期変性、95℃、5秒、60℃、30秒の45サイクル。目的の遺伝子の値はすべてハウスキーピング遺伝子（脂肪細胞は36B4、マクロファージと共培養体はβ-アクチン）の値で正規化した。 使用したマウスのプライマー配列を表1に示す。

データはThermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.)を用いて解析した。 サイクル閾値（Ct）値をプロットし、相対的な標準曲線を作成した。 各サンプルから得られたCt値をもとに、Takara Thermal Cycler Dice Real Time Systemソフトウェアで標準曲線を作成し、標的遺伝子の相対量を算出した

2.9. 脂肪細胞とマクロファージの分離

同数の培養3T3-L1脂肪細胞とRaw264.7マクロファージ（前述）を、CD11b MicroBeadsシステム（MACS；Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA）を用いて、製造者のプロトコルに従って分離させた。 簡単に言うと、共培養細胞を集め、バッファー（2mM EDTAと0.5%ウシ血清アルブミン-BSAを加えたPBS）で2回洗浄し、CD11bマイクロビーズとともに4℃で15分間インキュベートした。 洗浄・再懸濁した細胞をMACSカラムにアプライし、CD11b+細胞を保持し、陰性細胞（脂肪細胞）を通過させた。 その後、カラムをセパレーターから取り外し、適切なコレクションチューブに載せた。 適量のカラムバッファーをカラムにピペッティングし、カラムに付属のプランジャーを使用して陽性細胞（マクロファージ）を洗い流した。 この方法により、フローサイトメトリーで評価したところ、90%から95%の純度のCD11b+細胞が得られた。

2.10. フローサイトメトリー（FACS）解析

3T3-L1 adipocytes and Raw264.7マクロファージを肥満関連因子で処理したもの（前述のとおり）を穏やかにトリプシン処理し、PBSで2回洗浄し、Fcγ受容体遮断抗体（24G2）とともに氷上で10分間インキュベートし、フィコエリスリン（PE）結合抗4-1BBで染色（eBioscience, San Diego, CA, USA）、抗4-1BBL（eBioscience）、または抗ラット（eBioscience）、ゴールデンシリアハムスターIgG（eBioscience）、コントロールとして抗CD11b（eBioscience）により脂肪細胞／マクロファージのゲートを定義した。 その後、細胞をFACSバッファーで洗浄し、FACSCalibur（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）でCellQuestソフトウェア（BD Biosciences）により解析した。 グラフ中の数字は陽性細胞の割合を示す。

2.11. ウェスタンブロット分析

3T3-L1脂肪細胞を6ウェルプレートに1×106個/ウェルでプレーティングし、3E1（1μg/mL）またはラットIgGと3時間インキュベートした。Raw264.7マクロファージを6ウェルプレートに1×106個/ウェルでプレーティングして、r4-BB Fcまたは人間IgGで1時間コートした。 3E1処理脂肪細胞およびr4-1BB Fc処理マクロファージをPBSで洗浄し、溶解バッファ（10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0.5% deoxycholate, 1% IGEPALおよびprotease inhibitors cocktail）中に掻き出して再懸濁し、3000rpmで5分、遠心分離をした。 10〜30μgの全タンパク質を含むサンプルを、リン酸化IKK（I kappa B kinase alpha/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181）、総IKKβ、p-p38 MAPK（マイトジェン活性化-プロテインキナーゼ）、p-JNK（c-Jun amino-terminal kinase）、総JNK、p-Akt（プロテインキナーゼB; Ser473）、総Akt（Cell Signaling, Danvers, MA, USA）、およびIκBα（inhibitor of nuclear factor-κB alpha; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）、β-アクチン（Sigma）であった。

2.12. 統計解析

結果は、3つの独立した二重実施の平均値±SEMとして示した。 統計的比較はStudentの-testまたはDuncanのmultiple-range testを用いたANOVAで行った。 差は.

3 で有意であるとみなした。 結果

3.1. 脂肪細胞／マクロファージと脂肪組織における4-1BBと4-1BBLの発現

我々はまず、qRT-PCRを用いて脂肪形成中の4-1BBのmRNAレベルでの発現を測定した。 その結果、分化後のSVF由来脂肪細胞では、4-1BBの転写物のレベルが大きいことがわかった（図1（a））。 重要なことは、パルミチン酸やLPSなどの肥満関連物質が、SVF由来脂肪細胞の4-1BB転写物や腹膜マクロファージの4-1BBL転写物のレベルを有意に上昇させたことである（図1（b））。 3T3-L1脂肪細胞および/またはRaw264.7マクロファージにおいても、転写物のアップレギュレーションが確認された（図1(c)）。 また、FACS解析により、3T3-L1脂肪細胞上の4-1BBタンパク質およびRaw264.7マクロファージ上の4-1BBLタンパク質（図1（d））は、これらの肥満関連因子により増加することが明らかとなった。 また、共培養脂肪細胞／マクロファージ（図1（e））、HFDを与えた肥満マウスの副睾丸脂肪組織（図1（f））でも4-1BBおよび4-1BBLの転写物が増加した＜7506＞＜7396＞3.2． 脂肪細胞およびマクロファージにおける4-1BBおよび4-1BBL刺激による炎症性サイトカインの放出および炎症性シグナル分子の活性化

脂肪細胞上の4-1BBまたはマクロファージ上の4-1BBLが炎症性シグナルを提供するかを調べるために、それぞれの細胞タイプをこれらの分子を特異的に刺激する作動物質で処理した。 3T3-L1脂肪細胞は、アゴニスト4-1BB抗体（3E1）で48時間処理し、Raw264.7マクロファージをr4-1BB-Fcで24時間処理し、その後、それぞれの細胞における炎症性サイトカインのレベルを測定した。 脂肪細胞の4-1BB刺激、マクロファージの4-1BBL刺激ともに、mRNA（図2（a）、図2（c））、タンパク質レベル（図2（b）、図2（d））でMCP-1、TNF-α、IL-6などの炎症性サイトカインが顕著に増産されることが確認された。 脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌は、4-1BB刺激によって変化しなかった（データは示さず）。 マクロファージの4-1BBL刺激は、IL-10の転写物を減少させたが（図2（c））、IL-10タンパク質放出には変化が見られなかった（図2（d））。

図2

4->

図1BBまたは4-1BBL刺激により、脂肪細胞またはマクロファージからの様々な炎症性サイトカインの放出が促進される。 3T3-L1脂肪細胞とRaw264.7マクロファージをそれぞれ1μg/mLの3E1と100ng/mLのr4-1BB Fcで48-24時間処理し、MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-10の転写とタンパク質を測定した（a-b）、Raw264.7マクロファージで（c-d）。 IKKα/ββ（p-IKKα/βBα）/IKKβ、p-JNK/JNK、pAkt/Aktおよびβ-アクチンのリン酸化は、ウェスタンブロッティングにより測定した。 3T3-L1脂肪細胞を1μg/mL 3E1と3時間インキュベートし（e）、Raw264.7マクロファージを100ng/mL r4-1BB Fcと1時間インキュベートした（f）。 デンシトメトリーの結果は、コントロールに対するパーセンテージで示した。 データは、二重に行った3つの独立した実験の平均±SEMである。 ; ; （コントロールとの比較）

4-1BBおよび/または4-1BBLが脂肪細胞および/またはマクロファージにおいて炎症シグナルを活性化する分子メカニズムを理解するために、細胞内シグナル分子に対する4-1BB/4-1BBL刺激の影響を検証した。 脂肪細胞に4-1BBを刺激すると、p38 MAPKとJNKのリン酸化が増加し、NF-κBの上流分子であるIKKのリン酸化も増加し、IκBαの分解を誘導した（図2（e））。 を刺激すると、Akt、p38 MAPK、JNKのリン酸化が増加するが（図2（f））、IκBαタンパク質の分解（図2（f））とIKKのリン酸化には影響がなかった（データ示さず）。 4-1BBLシグナルはp38 MAPKを活性化するだけでなく、マクロファージのAkt活性化も誘導し、炎症性サイトカインの発現を増加させるというこれまでの報告と一致している。 接触培養系における炎症性サイトカインの放出

4-1BB/4-1BBL刺激により脂肪細胞および/またはマクロファージからそれぞれ炎症性サイトカインの放出が促進されたことから、表面分子（おそらく4-1BB/4-1BBL）を介した細胞間相互作用が炎症反応の開始と誘発に関与するかどうかを検討した。 まず、3T3-L1脂肪細胞とRaw264.7マクロファージを直接接触させて共培養し、炎症性サイトカインIL-6、MCP-1、TNF-αの産生が培養中のマクロファージの数と相関し（図3（a）〜3（c））、時間と共に増加する（図3（d）〜3（f））ことを見出した。

3.4. 4-1BBと4-1BBLの相互作用の破壊が接触共培養系における炎症性サイトカインの放出に及ぼす影響

接触共培養した3T3-L1脂肪細胞/Raw264.7マクロファージにおける炎症反応に、脂肪細胞とマクロファージ間の4-1BB/4-1BBLが媒介する相互関係が関わっているかを調べるために、中和抗体（TKS-1）を用いて相互関係をブロックしてみた。 この中和モノクローナル抗体は、マウス4-1BBLと特異的に反応し、それによって4-1BBLは4-1BB受容体に結合することができず、4-1BBLと4-1BBの相互作用を中断させることができる。 したがって、脂肪細胞における4-1BBを介したシグナルとマクロファージにおける4-1BBLを介したシグナルの両方は、TKS-1処理によって鈍化させることができる。 我々は、TKS-1による処理が、接触共培養脂肪細胞／マクロファージにおけるIL-6、MCP-1、およびTNF-α mRNAのレベルを有意に減少させることを見出した（図4（a））。 これらの炎症性サイトカインの発現低下は、タンパク質レベルでも確認された（図4(b)）。 さらに、4-1BBと4-1BBLの相互作用を破壊すると、脂肪細胞と共培養した腹膜マクロファージからの炎症性サイトカインの放出が減少することも見出した（図4(c))。 共培養した脂肪細胞／マクロファージにおける炎症性遺伝子発現に対する4-1BBおよび4-1BBシグナル伝達の相対的寄与を調べるために、マクロファージを脂肪細胞から分離し、2種類の細胞における炎症性サイトカイン転写物のレベルを測定した（図4（d））。 中和抗体は、マクロファージと同様に脂肪細胞におけるIL-6、MCP-1、TNF-α mRNAのレベルの増加を著しく減少させた（図4（e）および4（f））。 議論

肥満による脂肪の炎症は、脂肪組織へのマクロファージの動員によって特徴付けられ、マクロファージは炎症反応の重要な源である。 脂肪組織における炎症経路のトリガーとして、脂肪細胞とマクロファージの細胞間接触が重要であると考えられているが、どの分子が関与しているかは不明である。 最近の研究では、細胞間接触を介した共刺激受容体4-1BBとそのリガンド4-1BBLの関与が、様々な炎症反応を調節することが示されている . 我々は以前の研究で、4-1BBを欠損させると、マクロファージの動員や炎症性サイトカインの放出が減少し、脂肪の炎症が抑制されることを見いだした 。 これらの知見に基づき、我々は、4-1BB/4-1BBLを介した脂肪細胞とマクロファージの細胞間相互作用が、肥満による脂肪の炎症の発症や維持に重要である可能性を仮定している。 興味深いことに、脂肪細胞の4-1BB転写物およびマクロファージの4-1BBL転写物は、肥満関連因子（FFAやLPSなど）によって顕著に発現が上昇し、脂肪細胞／マクロファージの接触培養においても強く発現が増加した。 さらに、これらの分子の発現上昇に伴い、細胞からの炎症性サイトカインの放出が促進された。 これらの知見と、肥満脂肪組織における発現上昇および4-1BB欠損肥満マウスにおける脂肪の炎症の軽減は、4-1BBおよび4-1BBLが脂肪細胞/マクロファージによる炎症反応の発症および/または促進に関与していることを示唆している。

炎症反応の引き金となる炎症シグナルが、脂肪細胞上の4-1BBとマクロファージ上の4-1BBLのどちらに関与しているかを確認するために、4-1BBまたは4-1BBLのいずれかに特異的に結合するアゴニストで細胞を刺激した。 その結果、脂肪細胞上の4-1BBを刺激すると、炎症性サイトカインであるMCP-1、TNF-α、IL-6の放出が著しく増加することを初めて見出した。 また、マクロファージを活性化することが知られている4-1BBLを介した逆シグナルを刺激しても、炎症性サイトカインのレベルが上昇した。 最近、4-1BBシグナルは、リンパ球においてTNF受容体関連因子（TRAF）-2依存性のMAPK/NF-κB経路を活性化することが示されている。 脂肪細胞では、4-1BBの刺激はp38 MAPK、JNK、IKKを活性化し、IκBαタンパク質の分解を誘導することを見出した。 一方、4-1BBLを刺激すると、マクロファージではAktやp38 MAPKなどの炎症性シグナル分子が活性化され、これはこれまでの研究と一致している 。 さらに重要なことは、4-1BBL中和抗体で処理すると、共培養体における炎症性サイトカインの放出がmRNAとタンパク質の両レベルで減少することを見出したことである。 これらの知見は、脂肪細胞とマクロファージの間の4-1BB/4-1BBLを介した相互作用が双方向の炎症性シグナルを誘発し、肥満脂肪組織における炎症反応の強力な誘導因子であることを示唆している（図5）。

図5

4-1BB/4-1BBL を介した脂肪細胞とマクロファージの相互作用により引き起こされる双方向性のシグナル伝達の模式図である。 双方向のシグナル伝達に対する炎症性サイトカイン（MCP-1、TNF-α、IL-6）の放出は、脂肪の炎症に関与していると思われる。

興味深いことに、4-1BB/4-1BBL相互作用を破壊しても、共培養脂肪細胞およびマクロファージからの炎症性サイトカインの放出が完全に抑制されたわけではない。 これは、細胞間相互作用に関与し、炎症反応を媒介する他の細胞表面分子が存在するためと考えられる。 実際、脂肪細胞やマクロファージは、その表面に多くの炎症性レセプターやリガンドを発現している 。 例えば、脂肪細胞に発現しているCD40やヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）は、マクロファージの接触依存性シグナルのメディエーターと考えられており、これらの受容体のアブレーションは肥満による炎症反応を抑制します . このように、脂肪細胞とマクロファージの相互作用による炎症反応の開始と維持には、4-1BBや4-1BBL以外にも、他の受容体やリガンドが関与していることが考えられる。

結論として、双方向性のシグナルを発生する4-1BBと4-1BBLを介した脂肪細胞とマクロファージの接触依存的相互作用が、これらの細胞からの脂肪炎症性サイトカインの放出に重要な役割を果たすことを初めて明らかにした。 4-1BBおよび4-1BBLは、脂肪細胞とマクロファージの細胞間相互作用に関与する他の分子とともに、肥満による脂肪の炎症を予防するための貴重なターゲットとなり得る。

Conflict of Interests

著者は、利害の対立がないことを宣言する。

謝辞

この研究は、教育科学技術部（MEST）の資金による国家研究財団（NRF）助成金KOSEF（2009-0079485）による中堅研究プログラム、およびMESTの資金による韓国NRFの科学研究センタープログラム（食品&栄養ゲノムセンター）助成（2012-0000643）の支援を受けました

。