5-hydroxymethylcytosine and its potential roles in development and cancer

5-methylcytosine (5mC) とその酸化生成物の 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) の化学的構造. これらの修飾シトシン塩基は、受動的（複製依存的）および能動的（複製非依存的）なDNA脱メチル化のいくつかの経路に関与している可能性が指摘されている。 活性型脱メチル化経路の1つは、連続した酸化ステップと、それに続くチミンDNAグリコシラーゼ（TDG）による塩基除去修復（BER）スキームまたはシトシン（C）に戻る脱炭酸による5caCの除去であることが提案されている。 DNMT, DNA methyltransferase）

多くの組織では、かなりの量の5hmCが蓄積しており、この塩基が単にDNA脱メチル化につながる連続した酸化経路の一過性の中間体であるとしたら、予想されるよりもはるかに多い。 従って、5hmCは、独自の生化学的特性を持つエピジェネティック・モジュールである可能性がある。 5hmCの生成過程でメチル基が酸化されると、5mCと相互作用するはずのタンパク質の結合が阻害されるため、この機能は負の、あるいは反発的なものである可能性がある。 あるいは、5hmCに特異的に結合するタンパク質が存在すれば、その機能はポジティブなもの、あるいは指示的なものである可能性もある。 これまでに、UHRF1、MBD3、MeCP2、およびプロテオミクスによって同定されたいくつかのタンパク質が、少なくともin vitroで5hmCを認識する能力を示してきた。 しかし、これらのタンパク質が5hmCに結合することによる生物学的な役割については、まだ完全には明らかにされていない。

The role of 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development and differentiation

The functional role of 5hmC in mammalian genomes are also unclear. 哺乳類のライフサイクルの最初、精子によって卵子が受精すると、父方（精子由来）ゲノムの5mCのほとんどが酸化されて5hmCになる。 この酸化は、これまでDNAの「脱メチル化」を反映していると考えられていたが、父性ゲノムに特異的であり、母性ゲノム（卵子由来）はTet触媒による酸化から保護されている。 父方ゲノムの酸化は、卵母細胞や接合体に相当なレベルで発現している唯一のTet遺伝子にコードされているTet3によって触媒される。 マウスでTet3を遺伝的にノックアウトすると、父性ゲノムの酸化に失敗し、発達が損なわれ、周産期致死となる。

もう一つの重要な発達の移行には、始原生殖細胞（PGC）におけるグローバルなDNA脱メチル化であり、胚8日半から9日半ごろに始まり胚13日半近くで完了する。 PGCsにおけるメチル化消去のメカニズムは、これまでほとんど解明されておらず、論争の的となっていた。 長い間、この段階には複製に依存しない能動的なDNA脱メチル化が重要な経路として関与していると考えられてきた。 しかし、最近のデータでは、DNA複製時にメチル化維持が行われないために起こる受動的なメチル化消失が支持されている … この受動的な5mCの消失は、5mCが5hmCに変換されることによって効果的に開始されると考えられている。 Tet1とTet2は、この段階でPGCに最も多く発現している5mC酸化酵素である。 Tet1とTet2を欠損したマウスの子孫は、インプリント遺伝子におけるDNA脱メチル化が欠損している。 しかし、Tet1/2欠損動物は雌雄ともに生殖能力があり、雌は卵巣が小さく、生殖能力も低下していた。 Tet1およびTet2を欠損させたマウスは生存可能な成体を得ることができるが、その大部分は胚発生中または出生前後に死亡し、様々な発達障害を示す . このデータは、Tet1/2が誘発するPGCの5mC酸化が、生存可能な子孫を残すために絶対必要でないことを示唆している。 現在、接合体およびPGCにおけるDNA脱メチル化に関する情報は、例えばTAB-sequencingによって達成されるような、DNA配列レベルでの5hmCのより詳細な分析がまだ不足している … このような情報は、受動的（あるいは能動的）DNA脱メチル化の開始における5hmC形成の全体的あるいは局所的な関与を明らかにすることが期待される。 生殖細胞の初期化に塩基除去修復が関与していることは、それ自体、グローバルなレベルで作用しているとすれば、ゲノムの完全性の維持に多大なリスクをもたらすが、それ以外にも様々な説明が可能であろう。 あるシナリオでは、塩基除去修復活性の発生は、メチル化CpG部位のグアニン（グアニンは最も酸化されやすいDNA塩基）に対するTet酸化酵素活性によって触媒される誤った非標的酸化反応に対抗する必要性によって説明できるかもしれない。 また、5hmCはTetタンパク質によってさらに酸化され、おそらく特定の配列で5caCを形成し、TDGによって開始される塩基除去修復によって除去されるかもしれない。 例えば、ヒトの脳皮質のDNAでは、5hmCは全シトシンの約1％、全5mC塩基の20～25％のレベルである． これは、ハプロイドゲノム1個あたり約6,000,000個の5hmC塩基に相当する。 このことは、5hmCが哺乳類の脳において重要な機能的役割を担っていることを示唆している。 これまでの研究から、脳組織の5hmCは遺伝子領域内、すなわちプロモーターや遺伝子内領域、いわゆる遺伝子ボディに非常に多く存在することが明らかになっている。 プロモーター、CpGアイランド、CpGアイランドショア（エッジ）での5hmCの形成は、これらの領域に不適切に導入された5mCを酸化し、最終的に除去する修復過程と類似した機能を持つと考えられる。 プロモーターや遺伝子本体における5hmCの沈着は、しばしば遺伝子活性と正の相関を示す。 遺伝子本体と結合した5hmCがどのようにして転写量を増加させるのか、そのメカニズムは今のところ不明である。 1つの可能性として、5mCの酸化は、偽の遺伝子内アンチセンス転写を打ち消すことによって、転写に対する抑制効果を解放していることが考えられる。 5hmCは、MBD1、MBD2、MBD4などのメチルCpG結合タンパク質には認識されないが、脳に多く存在し、神経疾患であるレット症候群で変異しているメチルCpG結合タンパク質MeCP2には結合することができる。 MeCP2の全長ではなく、メチルCpG結合ドメイン（MBD）を用いた先行研究では、MeCP2が5hmCに結合するとは結論付けられていない。 これらの相違の理由は明らかではない。 なぜなら、5hmCの濃度は脳で最も高く、MeCP2はヒストンH1と同程度に脳内に豊富に存在するタンパク質であるからである。

最近示されたように、5hmCの形成は脳の発達に重要である。 この塩基は神経前駆細胞に比べ発達中の神経細胞に多く存在し、神経細胞の分化に重要な遺伝子の遺伝子体に特異的に局在している。 Tet3はマウスの大脳皮質で最も高発現し、Tet2がこれに続くが、Tet1のレベルはこの組織では非常に低い。 分化中の神経細胞におけるTet2、Tet3および5hmCのレベルの増加は、Polycomb H3K27メチルトランスフェラーゼEzh2の減少、および重要な遺伝子におけるH3K27me3の消失と一致している。 Tet2やTet3のレベルを下げたり、Ezh2の発現を増加させると、神経細胞の分化が不完全になるか、ブロックされることになる。

Loss of 5-hydroxymethylcytosine in cancer

The levels of 5hmC in cancer are strongly reduced relative the corresponding normal tissue surrounding the tumor. 液体クロマトグラフィー質量分析、抗5hmC抗体ベースのイムノドットブロット、免疫組織化学を用いて、肺癌、脳腫瘍、乳癌、肝臓、腎臓、前立腺、腸、子宮、メラノーマの腫瘍に関連した5hmCの喪失を証明した。 他の研究者も、様々なタイプの固形癌で5hmCの消失を示すことにより、この観察を確認した。 さらに、TET2の再導入により、5hmCレベルが回復し、メラノーマ細胞の転移能が低下することが示されている . また、組織切片を5hmCと増殖細胞のみに存在するマーカーであるKi67抗原に対する抗体で共染色すると、1つの細胞で5hmCとKi67が同時に存在することはほとんどないことが確認された . 臨床診断レベルでは、5hmCの消失とKi67陽性細胞の存在を組み合わせた免疫組織化学的解析が、がん診断のためのバイオマーカーとして開発される可能性がある。 腫瘍に5hmCが存在しない、あるいは強く減少していることは、増殖中の細胞が5hmCを失っていることを示唆している。 多くの場合、Ki67陽性細胞はまれであっても、腫瘍の大部分は5hmCが枯渇しており、これらの腫瘍細胞は過去に5hmCの喪失につながる増殖の歴史を持ち、その後再確立されないことが示唆される 。 5hmCの複製依存的な消失は、着床前胚において父方のDNAに最初に5hmCが形成された後、複製依存的にこのマークが消失または希釈されるという状況を彷彿とさせる。 同様に、正常組織の細胞が細胞培養に適応するにつれて、グローバルな5hmC含量は急速に減少する . 最も単純な説明は、5mCの酸化によってDNA中に半ヒドロキシメチル化されたCpG部位が生じ、DNA複製の際にDNMT1によって認識されないというものである。 このような説明は、DNMT1が5hmCを含むCpG部位で活動できないことを示したin vitroの研究と一致する。 しかし、癌における5hmCの減少については、他の説明も可能である。 腫瘍組織では、TETタンパク質のレベルが、対応する正常組織よりも低くなっている可能性がある。 肺癌と脳腫瘍では、TET1、TET2、TET3 の RNA レベルで正常組織との一貫した違いは観察されなかったが、他の研究者は癌における TET 遺伝子発現の低レベルを報告している。

Mutation of TET2 in human cancer

TET1 は、哺乳類の DNA において 5mC から 5hmC への変換を促進するタンパク質ファミリーに属している。 TETファミリーに属する3つのファミリーメンバーが確認されている。 TETファミリーにはTET1、TET2、TET3の3つのファミリーメンバーが確認されている。 TET1 はヒトの染色体 10q21.3 に、TET2 は染色体 4q24 に、TET3 は染色体 2p13.1 に位置しています。 TET1 はジンクフィンガーCXXC DNA 結合ドメイン、システインリッチ領域、2-オキソグルタル酸・鉄（II）依存性ジオキシゲナーゼ（2OGFeDO）ドメインから構成され、TET3 はジンクフィンガーCXXC DNA 結合ドメインから構成されている。 TET3もN-末端にCXXCドメインを持つ。 しかし、TET2遺伝子は進化の過程で染色体遺伝子逆位を起こし、CXXCドメインと触媒ドメインを分離し、IDAX/CXXC4という新しいCXXCドメイン遺伝子を生み出し、TET2の負のレギュレーターをコードしている … EST プロファイルと発現アレイに基づくと、TET1 は胚発生時に最も多く発現し、成体組織では関連する発現を示さな い。 白血病は、正常な造血幹細胞の分化の過程で、骨髄中の造血前駆細胞のクローン拡大がある段階で影響を受け、分化と自己再生のバランスが崩れる疾患です。 造血前駆細胞の不適切な増殖は、主に細胞の成熟が阻害されることによって起こります。 骨髄異形成症候群（MDS）造血障害は、細胞減少（血球数の低下）、1つの細胞系譜または別の細胞系譜における造血不全、急性骨髄性白血病（AML）への変化リスクの上昇を特徴とするものであります。 AMLでは、骨髄における異常な白血球の急速な増殖により、他の細胞系譜の様々な細胞の産生が阻害されます。

TET2は骨髄増殖性新生物（MPN）、MDS、AML、慢性骨髄単球性白血病（CMML）の患者で変異が見つかっており、MDSでは最もよく変異する遺伝子である 。 TET1 や TET3 の変異は MDS では観察されず、TET2 変異は他のいくつかのよく知られた変異と相関している。 興味深いことに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1/2 (IDH1/2) 変異は、TET2 変異と一緒に見つかることはほとんどありませんが、造血幹細胞 (HSC) に対して TET2 変異と同様の影響を及ぼします …。 TET2 変異は、野生型 TET2 を持つ患者と比較して、AML における全生存期間の短縮と関連していますが、MDS および MPN 患者における TET2 変異は AML への進行を促進します ………また、TET2 変異は、造血幹細胞（HSC）に対する TET2 変異と同様の影響を与えます。 TET2 遺伝子は合計 11 個のエクソンからなり、2002 アミノ酸のタンパク質産物に翻訳される。 骨髄系癌における TET2 変異は、最も長いエクソンである 3a と 10 に最も多く観察されている。 MPNでは、造血系における多能性前駆細胞およびコミットメント前駆細胞の両方がTET2変異の標的となり、TET2が骨髄形成に重要な役割を担っていることが示唆されている … TET2 の欠失とヘテロ接合性喪失または片親ディスオミーは、TET2 が変異した MDS/AML 患者 (9%) で観察され、野生型アリルが組み換えの際に失われ、変異した TET2 が機能喪失の表現型を促進することが可能であるようだ。 Kosmiderらは、変異型TET2患者の50％が2つのTET2コピーを標的とした遺伝子欠損を有していることを観察した。 TET2の変異は機能喪失につながるようであり、腫瘍抑制的な役割を担っている可能性を示唆している。

機能を欠く変異型TET2の根本的な意味と骨髄性悪性腫瘍におけるその役割を理解することは現在の研究優先事項である。 いくつかの研究室は、重要なTet2エクソンを標的とした条件付きTet2ノックアウトマウスモデルを作成した。 Moran-Crusio らは、 Tet 2-/- マウスが20週齢で脾臓腫大を発症し、変異型 TET2 を持つヒト CMML 患者に見られる表現型と類似していることを確認しました。 異なるマウスモデルのデータから、同様の観察が導かれたのです。 Tet2の欠失は胚性致死ではない。 Moran-CrusioらおよびKoらによる主要な観察は、Tet2-/-マウスからの造血幹細胞が、Tet2+/+細胞からの造血幹細胞との競合による再構成アッセイ中に、in vivoで造血区画を再増殖する能力が増大することである。 Tet2-/-マウスの様々な臓器を分析した結果、Tet2の喪失はTet1やTet3の発現の増加によって補われないことが示された 。 Tet2-/-マウスの骨髄および脾臓では5hmCレベルが有意に減少していた。 Tet2-/-マウスの造血幹細胞は増加し、骨髄前駆細胞はわずかに増加し、造血は単球／マクロファージ系に偏っていた ……また、Tet2-/-マウスの造血幹細胞は、単球／マクロファージ系に偏っていた。 このことから、Tet2が活性化することで、造血幹細胞の適切な系統分布と分化の制御が可能となり、正常な造血が行われることが示唆された。 特に興味深いのは、TET2変異がゲノム中の5mCのレベルやパターンに及ぼす影響である。 しかし、現在のデータは明確とは言い難い。 ある報告では、AMLにおけるTET2突然変異はDNA高メチル化の表現型と関連しているとされているが、他のデータでは、TET2突然変異を有する患者の骨髄サンプルは低い5hMCレベルとDNA低メチル化であることが示唆されている 。 造血器悪性腫瘍は、EZH2、IDH1、IDH2、MLL、DNMT3A、ASXL1などのエピジェネティック修飾因子における変異によって特徴づけられることが多いため、状況は複雑で、直接的な関連性が不明瞭になる可能性がある . 例えば、ある研究では、T細胞リンパ腫のDNMT3A変異を持つ11人の患者のうち8人（73％）は、TET2変異も持っていた。 この補酵素はトリカルボン酸サイクルの中でIDHという酵素によってイソクエン酸から生成される。 興味深いことに、ヒトの腫瘍の中にはIDH1遺伝子に変異を持つものがいくつかある。 IDH1変異は特にグレードIIおよびIIIの神経膠腫で頻繁に見られ、患者の70%に見られる。 IDH1およびIDH2の変異は骨髄性白血病や他のいくつかの悪性腫瘍でも見られるが、頻度は低い。 これらのIDH1変異は遺伝子全体に散在しているわけではなく、ほぼ独占的にアミノ酸位置132に見られる。 この発見は、この特定のIDH1変異タンパク質が機能獲得性を持つことを示唆している。 驚くべき発見は、IDH1のコドン132のアルギニンからヒスチジンへの変異体が、2-オキソグルタル酸ではなく、オンコメタボリックの2-ヒドロキシグルタル酸（2HG）を反応生成物として生成することであった 。 この変異体が行うイソクエン酸酸化反応は不完全で、2HGのみを生成しているようである。 さらに、2HGは2-オキソグルタル酸依存性酵素活性の全てではないにしても、多くの酵素活性に対して競合的阻害剤であることがわかった。 TETタンパク質はそのような酵素の1つのクラスを表し、2HGはTET1およびTET2の阻害剤であることが示された。

イソシトレート脱水素酵素による2-オキソグルタル酸の産生。 2-オキソグルタル酸は、5-メチルシトシン（5mC）を5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）に酸化するTen-elevenトランスロケーション（TET）タンパク質の補因子となる。 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（IDH）1変異体R132Hは2-ヒドロキシグルタル酸（2HG）を生成し、TETタンパク質を含む2-オキソグルタル酸依存性酵素の競合阻害剤となる。 2HGによるTET活性または他の2-オキソグルタル酸依存性酵素の阻害は、IDH1変異細胞のゲノムにおける5mCのパターンに影響を与える可能性がある。

グリオーマ腫瘍におけるIDH1変異の興味深い相関性の一つは、IDH1変異腫瘍はほとんど常にCpG島の広範囲の過メチル化で示されるDNAメチル化の豊かなゲノム全体の変化と関連しているという点である . この表現型はCpG-island methylator phenotype (CIMP)と呼ばれている。 IDH1変異グリオーマにおけるCIMPは、TET活性が2HGによって損なわれているため、これらの腫瘍における5hmC産生の失敗と関連していると推定するのは魅力的である。 実際、ヒトのアストロサイトにIDH1変異体コンストラクトを実験的に導入すると、CIMPに似た表現型が出現した 。 さらに、最も一般的なIdh1変異体R132Hを内在性Idh1遺伝子座に挿入し、造血細胞で発現させたコンディショナルノックインマウスでは、DNAハイパーメチル化が観察された . しかし、IDH1変異型とIDH1野生型グリオーマのDNA中の5hmCレベルを直接比較したところ、これら2つのカテゴリーの脳腫瘍の間に実質的な差は観察されなかった . したがって、変異型IDH1とその代謝産物である2HGはTET酵素に影響を与えるだけでなく、2-オキソグルタル酸や他の2-オキソグルタル酸依存性酵素に依存する多くのリジン脱メチル化酵素も阻害することを念頭におく必要がある。 これらのリジン脱メチル化酵素の機能障害は、CpGアイランドのDNAメチル化パターンに二次的な影響を及ぼすと考えられる

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